复杂先心病TGA的基因组学及其网络调控机制研究培训课件

复杂先心病（TGA）的基因组学及其网络调控机制研究

钟诗龙博士副研究员广东省人民医院医学研究中心、广东省心血管病研究所病因与致病机制不明确：包括遗传与环境因素先天性心脏病在活产婴儿中的发病率为8-14.6‰严重影响威胁人口素质，给社会和家庭带来极大负担尽管介入与手术能有效治疗先心病，但先心病的几个关键问题还没有解决确定病因，有效预防实现早期诊断疾病、明确疾病分类预测预后，进行个体化干预阐明发病机制，发现治疗靶标随着理论与技术的发展，基因组学研究在先心病研究中扮有重要作用。提纲基因组学的分子生物学基础；先心病的基因组学：染色体变异单基因突变；多基因突变TGA的基因组学及其网络调控机制研究简介DNAmRNA(messenger)ncRNAProteinRibosometranscriptiontranscriptiontranslationEpigenetics先心病的分子生物学基础：中心法则序列变异

单核苷酸（突变、SNP和indel）结构变异微星、拷贝数变异（CNV）亚染色体组整个染色体组或基因组提纲基因组学的分子生物学基础；常见先心病的基因组学：染色体变异单基因突变；多基因突变TGA的基因组学及其网络调控机制研究简介先心病的遗传学染色体异常引起的合并先心病的综合症13三体

1:15,00018三体

1:5,00021三体(Downsyndrome) 1:80022q11缺失：法洛四联症、DiGeorge综合征其他较少见的染色体缺失包括：9q34,1q21.1,16p11.2and17p11.2.Page85321三体-唐氏综合症产前诊断绒毛膜绒毛活检>10/40Miscarriage1%Results:~1week羊膜腔穿刺>14/40Miscarriage0.5%Results:~3weeks

用高通量测序法检测胎儿非整倍体ProcNatlAcadSciUSA.2008Dec23;105(51):20458-63BMJ.2011Jan11;342:c7401怀孕年龄35.4岁，取血样时怀孕时间13周又1天提纲基因组学的分子生物学基础；常见先心病的基因组学：染色体变异单基因突变；多基因突变TGA的基因组学及其网络调控机制研究简介先心病的遗传学基因突变引起的先心病基因综合征心脏畸形TBX1基因DiGeorge综合征主动脉离断、永存动脉干（PTA）、法洛四联症（TOF）、右室双出口和大动脉换位TBX5基因Holt-Oram综合征心脏畸形包括房间隔缺损（ASD）、TOF和房室传导阻滞等TFAP2β基因Char综合征动脉导管未闭PTPN11基因Noonan综合征胸部畸形和肺动脉狭窄（PS）NOTCH通路JAG1、NOTCH2基因突变Alagille综合征动脉-肝脏发育不良、肺动脉流出道或外周肺动脉的狭窄HOLT-ORAM综合征和TBX5基因Holt-Oram综合征主要表现为肢体和心脏畸形，故又称为心-手综合征单倍体TBX5基因可导致Holt-Oram综合征，TBX5基因突变也是人类首个在心脏间隔缺损畸形中找到的单基因突变。TBX5基因的错义突变导致心脏或肢体的畸形则取决于其突变的位点单基因先心病的遗传模式有一些显示出明显的孟德尔遗传模型；有的显性遗传、有的隐性遗传、有的伴性遗传；有一些是为一个基因的结构或功能的改变，即“单基因突变”；估计这种遗传缺陷占8%；但是大部分的先心病是多基因突变的结果。提纲基因组学的分子生物学基础；常见先心病的基因组学：染色体变异单基因突变多基因突变TGA的基因组学及其网络调控机制研究简介与遗传性心脏疾病相关的致病基因突变肥厚性心肌病扩张性心肌病致心律失常性右室心肌病长QT综合症Brugada综合征基因发生%基因发生%基因发生%基因发生%基因发生%MYH712–20%LMNA2–6%PKP211–43%KCNQ130–35%SCN5A20–25%MYBPC320–28%MYH74–7%DSG27–26%KCNH225–30%GPD1LTNNT22–5%MYBPC33–7%DSP6–16%SCN5A5–10%CACNA1CTNNI31–3%TNNT21–4%DSC2KCNE1<1%CACNB2TPM11–3%SCN5A2–3%JUPKCNE2<1%SCN1BMYL21–3%LDB31–3%RYR2ANK2KCNE3ACTC1<1%PLN1–3%TGFB3KCNJ2SCN3BMYL3<1%ACTN2<4%TMEM43CACNA1CGLA<1%VCL<3%DESCAV3LAMP2<1%SGCD<3%SCN4BPRKAG2<1%CSRP3<2%AKAP9TNNC1DES<2%SNTA1MYH6TNNI3<1%MYO6TPM1<1%TTNACTC1<1%CSRP3TCAP<1%MYOZ2ABCC9<1%VCLCTF1<1%TCAPTNNC1ACTN2MYH6LDB3TTNPLNTAZJPH2EMDTTRLAMP2MYLK2PSEN1CAV3PSEN2MTTIEYA4致病基因突变的发现有助于基因诊断如对有肥厚性心肌病的母亲进行基因检测，可以预测其子女的风险。但是如何决策?基因突变用于诊断与预测——对遗传性心血管病家庭进行遗传学检测的决策树CaleshuCetal.Heart2010;96:1669-1675检测先心病患者致病突变可能致病突变未知功能突变阴性或良性突变检测没有发病家族成员阳性结果遗传咨询临床监护阴性结果无危险无需进一步检测基因诊断检测：益处与风险益处风险基因诊断检测可以:确定胎儿或个体是否处于遗传疾病的风险当胎儿处于风险是，可以是父母和医生考虑尽早作出产前诊断性选择。检测结果也可以:使个人和家人难于决断；可能负面影响家庭稳定性和个人关系基因突变用于预测预后：

双基因突变对肥厚性心肌病模型小鼠生存的影响有2个致病基因突变的个体比只含1个突变的家族性肥厚性心肌病病人更易发生严重的心衰Circulation.2008;117:1820-1831肥厚性心肌病模型小鼠目前已知的基因突变仅能部分解释先心病发病率：以肥厚性心肌病为例对80个不相关的先症者进行7个HCM基因(b-MHC,MyBP-C,cTnT,cTnI,ACTC,MYL2,andMYL3)作基因突变检测在23个先症者中检测到26个基因突变，发生率为(29%)以往的研究主要集中在候选的信号通路或基因在全基因组范围全面发现新的先心病的致病基因突变，阐明其遗传传递规律，并系统地揭示其致病机制成为目前全世界研究重点。JMedGenet2005;42:e59提纲基因组学的分子生物学基础；常见先心病的基因组学：染色体变异单基因突变多基因突变TGA的基因组学及其网络调控机制研究简介外显子组测序发现完全性大动脉转位（TGA）的致病基因突变及其致病机制研究TGA流行病学TGA是新生儿期最常见的紫绀型先天性心脏病，发病率为0.2‰-0.3‰，约占先天性心脏病总数的5％-7％，男女患病之比为2-4：1。若不治疗，约90％的患者在1岁内死亡。TGA严重影响威胁人口素质，给社会和家庭带来极大负担。TGA解剖与功能分类TGA+IVSTGA+VSDTGA+AoCoa(RVOTO)TGA+PS(LVOTO)在病理上：大动脉转位时，主动脉瓣下圆锥发达，未被吸收，主动脉位于左前上方；肺动脉瓣下圆锥萎缩，肺动脉位于作后下方。发病原因及其发病机制目前还不清楚。以往的研究主要集中在与体轴形成有关的信号通路或基因发现了一些TGA致病基因变异：CFC1、GDF1、NODAL等NODAL信号通路与左右体轴形成有关TGA的致病基因突变基因位置突变类型CFC1exon4splicedonorsiteIVS4DSDUPGDF1exon3CYS227TERFOXH1exon1Pro21SerNODALexon29-BPINSERTION/24-BPDELETION,NT700

Donorsplicesiteofintron2IVS2DS,G-A,+1

exon3IVS2-1G→CMED13Lexon6752A-G\GLU251GLY

exon255615G-A、ARG1872HIS

exon286068A-G\ASP2023GLYZIC3exon21741A-T,LYS-TER

exon1763T-G,TRP255GLY

exon1GLY17CYSNKX2.5exon2VAL150ILE这些突变不足以解释TGA的高发病率；尤其在中国人中：我们在28个TGA患者及10个家系成员中没有检测到这些突变科学问题能否在全外显子组范围找到引起TGA的致病基因突变？它们在父代与子代之间的传递规律如何？明确其传递规律将为早期诊断提供TGA分子预警的标记。通过系统生物学的方法识别基因组中关键节点基因及其网络，对于致病基因突变的机制研究具有方向性指导作用。高糖对致病基因突变有没有协同作用？全基因组外显子测序（EXOMESEQUENCING）外显子组测序是一种新型的基因组分析技术，只需针对外显子区域的DNA即可，能够发现位于编码区的SNPs和小的InDels。因此与全基因组重测序相比，外显子组测序更加简便、经济、高效，已成为现阶段基因测序工作的重心权重基因共表达网络分析权重基因共表达网络分析是一种用于解析分子作用机制和网络关系的系统生物学方法。它充分利用基因表达的内在信息，把高度关联的转录子聚类成一族，称作一个模块(module)，然后识别与临床相关的模块，最后用模块内连通性（intramodularconnectivity）和基因重要性（genesignificance）识别信号通路上关键调控基因（Hubgenes）。网络构建Tools:Pearsoncorrelation,SoftthresholdingRationale:makeuseofinteractionpatternsbetweengenes模块识别Tools:TOM,HierarchicalclusteringRationale:module-(pathway-)basedanalysis找到模块代表性基因Tools:eigengene(1stPrincipalComponent)‏Rationale:Condenseeachmoduleintooneprofile进一步分析模块相关性，模块重要性、析因分析等.第一部分：全基因组外显子测序寻找TGA的致病错义基因突变1.筛选阶段完全性大动脉转位患者(12例)Agilent全外显子捕获＋Solexa测序生物信息学分析注释和统计分析、排除非基因、内含子、同义突变、已知SNP

潜在致病突变Sanger测序排除没有验证的潜在致病突变

TGA患者150例包括核心家系50个健康志愿者500例基因型与表型是否发生共分离验证潜在致病突变2.验证阶段TGA主动脉瓣下圆锥组织权重基因共表达网络分析TGA肺动脉瓣下圆锥组织TGA肺动脉瓣下圆锥与干下型肺动脉瓣下圆锥的差异模块干下型患者的肺动脉瓣下圆锥组织TGA的关键信号通路及关键节点基因TGA主动脉瓣下圆锥与干下型肺动脉瓣下圆锥的差异模块TGA的差异模块1.权重基因共表达网络分析识别TGA的关键信号通路及关键节点基因，第二部分：致病错义基因突变的分子机制野生型致病基因P19细胞功能Nodal信号应答突变型致病基因基因突变