2-2动物细胞工程

动物细胞工程（含胚胎工程）发展史【科技探索之路】P32希普：首例胚胎移植成功哈里森:首创动物组织体外培养法张明觉：发现哺乳动物精子获能现象格登、童第周：体细胞核移植成功试管家兔诞生米尔斯坦和科勒：创立单克隆抗体技术胚胎分割移植成功埃文斯：成功分离和培养小鼠的胚胎干细胞克隆羊多莉诞生山中伸弥：获得诱导多能干细胞单细胞基因组测序进行遗传病筛查的试管婴儿诞生我国科学家首次培育了体细胞克隆猴。1890年1907年1951年1958年1959年1975年1978年1981年1996年2006年2014年2017年[课前活动]阅读P43-54，快速找答案动物细胞工程的3大技术（牢记）动物细胞工程3大技术动物细胞培养技术动物细胞融合技术动物细胞核移植技术动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础第2节动物细胞工程一动物细胞培养

【本节聚焦】1.动物细胞培养需要哪些基本条件？2.动物细胞培养的基本操作过程是什么？3.怎样客观分析干细胞在临床上的应用所产生的效益与风险？从社会中来

皮肤的自体移植小面积烧伤：患者通过切除+植皮(自身)后恢复大面积烧伤？患者自身的不够用，如何解决？（1）使用他人皮肤如何？（2）培养自身细胞？目前，科学家还在研究对皮肤干细胞进行培养，以获得适合临床上使用的人造皮肤。人造皮肤动物细胞培养【概念】动物细胞培养是指从动物体中取出相关的__________，将它们分散成_________，然后在_________________下，让这些细胞______和______的技术。生长组织单个细胞适宜的培养条件增殖

原理：细胞增殖目的：获得细胞或细胞产物相关组织：一般是指动物胚胎或幼龄动物的组织（分化程度低，分裂能力强，容易培养）适宜的培养条件：充足的营养、稳定的内环境（不同的细胞、组织适合生存的环境不同）[思考]动物细胞培养需要哪些必要的条件呢？一、动物细胞培养的条件

体内细胞维持生命活动和增殖需要营养和稳定的内环境，体外培养细胞需要类似的以下条件：（一）营养基本营养：水、无机盐、有机碳源、有机氮源特殊营养：维生素（相应动物）血清（含有尚未研究清楚的细胞所需的营养物质）营养基构成：合成培养基+血清等一些天然成分[思考]从物理状态划分，培养基的类型是什么？液体培养基（培养液）（二）无菌、无毒的环境措施1：灭菌处理[思考]灭菌处理的对象有哪些？培养液和所有培养用具措施2：操作在无菌环境下进行措施3：定期更换培养液[思考]定期更换培养液的目的是什么？清除代谢物，防止代谢物积累对细胞自身造成危害（三）温度、pH和渗透压（与相应动物内环境的理化性质保持一致）添加抗生素，以防培养过程中污染①适宜的温度：哺乳动物细胞培养的温度多以______________为宜36.5±0.5℃②适宜的pH：多数动物细胞生存的适宜pH为___________7.2-7.4③适宜的渗透压：维持细胞正常的形态和功能（四）气体环境①气体的组成及作用：O2：CO2：细胞代谢所必需维持培养液的pH②容器：通常采用培养皿或松盖培养瓶。③仪器：置于含有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中进行培养。一、动物细胞培养的条件练一练一般来说，动物细胞体外培养需要满足的条件是()①无毒的环境②合成培养基里需添加血清等③无菌的环境④温度一般与动物体温接近⑤只有O2的气体环境⑥能调节培养液pH的CO2

A.①②③④⑤⑥B.①②③④⑤C.①③④⑤⑥D.①②③④⑥D血清练一练

动物细胞体外培养时，通常要在培养基中补充一定浓度的某些物质。下图表示血清对正常细胞和癌细胞培养的影响。下列叙述正确的是()A.补充血清后，正常细胞与癌细胞的增殖速率相同B.动物细胞培养过程中，是否添加血清均可C.培养基中补充血清对正常细胞的促进作用更明显D.培养基中是否补充血清对正常细胞培养影响不大C[思考]

具备了动物细胞培养的必要条件后，如何进行细胞培养？二、动物细胞培养的过程[活动1]带着以下问题阅读教材P44-45。1.为何动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞呢？可用什么方法？2.体外培养动物细胞有哪些类型？3.什么是细胞贴壁？什么是接触抑制？4.什么是原代培养和传代培养？5.为什么要进行分瓶培养？怎么处理？6.动物细胞培养与植物组织培养有什么相同之处与不同之处？取动物组织用机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理（避免限制生长增殖）【注意】相关酶可使细胞裂解，应注意用量和时间分散成单个细胞加培养液细胞悬液放入培养皿或培养瓶内原代培养原代培养指动物组织经处理后的初次培养悬浮生长贴壁生长(大多数）贴壁生长

某些细胞需要贴附于某些基质表面才能增殖，这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上。细胞密度过大、有害代谢物积累、营养物质缺乏等细胞分裂受阻接触抑制

当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞停止分裂增殖的现象。接触抑制接触抑制现象圆球形细胞刚开始铺展贴壁生长（100×）培养的动物细胞贴壁生长并进行有丝分裂（100×）细胞单层贴壁生长铺满瓶壁后出现接触抑制（100×）单层细胞多层细胞取动物组织用机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理分散成单个细胞加培养液细胞悬液放入培养皿或培养瓶内原代培养传代培养分瓶后的细胞培养。悬浮生长贴壁生长(大多数）细胞密度过大、有害代谢物积累、营养物质缺乏等细胞分裂受阻接触抑制解决分瓶培养传代培养①收集细胞a.悬浮培养的细胞：直接用离心法收集b.贴壁细胞：用胰蛋白酶处理分散成单个细胞，用离心法收集②制成细胞悬液，分瓶培养[思考1]进行动物细胞培养时常用胰蛋白酶分散细胞，这说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶行吗？说明细胞间的物质主要是蛋白质。

胃蛋白酶作用的适宜pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就失去活性，多数动物细胞培养的适宜pH为7.2-7.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性，所以用胃蛋白酶不行。[思考2]动物细胞的整个培养过程中可能多次用到胰蛋白酶或胶原蛋白酶？第一次使用的目的是使组织细胞分散开。贴壁细胞传代培养时使用的目的是使细胞从瓶壁上脱离下来，分散成单个细胞，便于分瓶后继续培养。[思考3]为什么要分散成单个细胞培养？①分散不会限制彼此的生长与增殖；②分散有利于与培养液充分接触，保证O2与营养供应和代谢物及时排出。[思考4]正常细胞能否一直传代培养下去？传代培养部分细胞的细胞核型可能会发生变化，增殖缓慢，甚至完全停止大部分细胞衰老死亡少数细胞会克服细胞寿命的自然极限，获得不死性，这些细胞已经发生了突变，正朝癌细胞发展10-50代继续培养（50代以后）（有限细胞系）（无限细胞系）使用或保存的细胞通常为10代以内，以保持细胞正常的二倍体核型(遗传物质不改变)。这一阶段的细胞称为细胞株细胞系的遗传物质一定改变P45【思考.讨论】2.动物细胞培养PK植物组织培养获得细胞或细胞产物常用固体培养基新植株葡萄糖、动物血清常用液体培养基细胞增殖细胞的全能性许多细胞快速繁殖等蔗糖、植物激素①培养过程细胞都进行有丝分裂，无减数分裂②均需无菌操作，需要适宜的温度、pH等条件原代培养、传代培养脱分化、再分化练一练

下列关于动物细胞培养的叙述,错误的是()A.动物细胞培养的原理是细胞的全能性。B.传代培养时需要用胰蛋白酶处理贴壁生长的细胞。C.癌细胞在培养瓶中不会出现接触抑制现象。D.动物细胞培养一般需要使用CO2培养箱。A练一练

下图所示是某动物细胞培养时，培养液中活细胞和死亡细胞的密度统计结果。下列相关叙述错误的是()A.实验中要控制胰蛋白酶溶液的浓度和处理时间，以免损伤细胞。B.培养液中应适当加入青霉素、链霉素,以避免杂菌污染。C.曲线BC段变化的主要原因是培养液中营养物质不足及有害代谢物积累等。D.培养至第6天时，新产生的细胞数等于死亡细胞数。D三、干细胞培养及其应用1.干细胞的概念：

动物和人体内仍保留的_____具有_____和______能力的细胞。在一定条件下，干细胞可以分化成其他类型的细胞。2.干细胞的分布：干细胞存在于__________、______和________等多种组织和器官中早期胚胎骨髓脐带血包括

和

、

等。胚胎干细胞成体干细胞iPS细胞再生医学、药物安全与有效性检测；导致肿瘤的风险3.干细胞的分类：4.应用及局限性：少数分裂分化[活动2]阅读P46—47，完成以下填空。早期胚胎中具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。胚胎干细胞分布特点应用实例在体外分化成心肌细胞、神经元细胞和造血干细胞等ES细胞局限性必须从胚胎中获取，涉及伦理问题；因而限制了在医学上的应用。三类干细胞三类干细胞骨髓以外的血液造血干细胞（返现最早研究最多，骨髓、外周血和脐带血中）神经干细胞（神经系统中）精原干细胞（睾丸中，分化成精原细胞）成体组织或器官内具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。与组织器官的发育再生和修复有关，应用广泛。成体干细胞分布举例特点应用实例治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病造血干细胞→神经干细胞→治疗细胞损伤造成的疾病三类干细胞通过体外诱导小鼠成纤维细胞得到的类似胚胎干细胞的一种细胞①将特定基因或特定蛋白导入细胞

（成纤维细胞、已分化的T细胞、B细胞）诱导多能干细胞概念制备方法(相关信息)应用优点iPS细胞②用小分子化合物诱导形成。①诱导过程无须破坏胚胎；②iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。可治疗镰状细胞贫血症；在治疗阿尔兹海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展【小结】干细胞培养及其应用

来源或存在功能、特点局限性胚胎干细胞(ES细胞)成体干细胞诱导多能干细胞(iPS细胞)早期胚胎能够分化成为动物体内的任何细胞，并进一步形成组织、器官甚至生物个体成体组织或器官，如造血干细胞、神经干细胞和精原干细胞等体外诱导体细胞产生能分化成为具有特定功能的细胞来治疗疾病。无须破坏胚胎，且避免免疫排斥反应。具有组织特异性，能分化成特定的细胞或组织不具有发育成完整个体的能力需从胚胎中获取，涉及伦理问题，限制了它在医学上的应用技术不成熟练一练

P47【练习与应用】一、概念检测1.判断下列有关动物细胞培养的表述是否正确。（1）培养环境中需要O2，不需要CO2。（）（2）细胞要经过脱分化形成愈伤组织。（）（3）培养液中通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清（）（4）培养瓶中的细胞需定期用胰蛋白酶处理，分瓶后才能继续增殖（）2.干细胞有着广泛的应用前景。下列相关叙述错误的是()A.干细胞是从胚胎中分离提取的细胞B.造血干细胞可以分化为各种血细胞C.不同类型的干细胞，它们的分化潜能是有差别的D.由iPS细胞产生的特定细胞，可以在新药的测试中发挥重要作用×√××A练一练

P47【练习与应用】二、拓展应用

现在关于iPS细胞的研究正在不断深入。请你从以下两个方面来查阅资料进行思考。（1）由于诱导iPS细胞、促使其分化都需要时间，因此用某人特异的iPS细胞进行医疗只限于时间比较充裕的情形。从实际事故、疾病发生的不可预测性方面考虑，如果要将这些细胞用于紧急情况，应该提前采取什么措施?（2）如果诱导iPS细胞定向分化为生殖细胞的技术发展成熟，该技术可能会有哪些应用？又可能带来哪些问题？像