医学硕士研究生开题报告范文3

导师XX教授

研究生XX五、预期目标六、已具备条件和个人条件七、前期工作基础（可行性）八、研究工作的主要阶段、进度和完成时间九、经费预算十、实验风险及前景分析

三立论依据和国内外研究现状1.脊髓损伤严重威胁人们的健康和生活质量，被视为临床治疗的难题。脊髓损伤后的修复一直是神经科学研究领域的一大难题。近年来神经干细胞的发现及其相关研究为脊髓损伤的治疗提供了一种新的策略。2.胶质细胞是神经系统中除神经元外的另一类细胞成分。数量上胶质细胞远多于神经元，有报道CNS内胶质细胞与神经元的数目之比为10：1～50：1。星形胶质细胞约占正常成人中枢神经系统细胞总数的40％。星形胶质细胞在中枢的作用不仅仅是保护、营养和支持，还参与血－脑屏障的构成、水的转运、递质的代谢和释放、离子平衡的维持等[6~8](VanDcGraaff,1998;SulyoklE,2004;朱长庚.神经解剖学)。胶质纤维酸性蛋白（glialfibrillaryacidicprotein，GFAP）是构成神经胶质细胞的主要细胞骨架蛋白，其表达的高低可以反映胶质细胞的功能状态[9](BiginiP,2001)。活化的星形胶质细胞内GFAP的增高，可能起保护神经元的作用，星形胶质细胞在损伤区分泌多种神经营养因子，以促进中枢神经和周围神经轴索的生长和存活[10](JCdelaTorre,2002)。很多研究表明PCD存在于神经系统发育的多个环节[11](NaruseI,1995)，从未分化的神经上皮到迁移后的有丝分裂后细胞，从神经管的形成[12](李泽桂,1999)到神经元与靶区的匹配都有PCD发生，凡不能与靶区正确匹配和参与正常神经网络形成的神经元均通过PCD加以清除[13](HommaS,1994)。

配制方法：封闭用正常血清原液可用PBS或TBS稀释成5-10%（即1：10-1：20倍稀释）后使用。3％H2O2

厂家：天津市化学试剂三厂批号：050905

配制方法：30%H2O250ml

+

蒸馏水450mlNestin、NeuN、GFAP抗体

Nestin：Chemicon公司（批号MAB5326)

NeuN：Chemicon公司（批号MAB377）

GFAP：Upstate公司（批号07－650）－20

℃冰箱保存，稀释后4℃保存PV－9000免疫组化试剂盒

厂家：中杉公司

Lot:509102-8℃保存DAB显色液（ZLI-9032）批号：13861842-8℃保存PBS缓冲液柠檬酸盐修复液TUNEL－POD试剂盒厂家：Roch公司批号：4.2仪器或设备：(1)高压锅:厂家：潮安县顺发五金制品有限公司批号：xk16-203-00048(2)显微镜:厂家：Olympus

批号：XS-212-201(3)LX-100手掌型离心机厂家：江苏海门麒麟医用仪器厂(4)HT-200微量电子天平厂家：成都善瑞逊电子有限公司(5)LX-100手掌型离心机厂家：江苏海门麒麟医用仪器厂3.实验详细步骤（1）取材（2）固定（3）制作石蜡切片Ⅰ放入包埋盒中已固定好的组织用自来水冲洗24小时（为了把甲醛除去）；Ⅱ脱水；Ⅲ透明；Ⅳ浸蜡；Ⅴ切片：切成5μm厚的切片；Ⅵ贴片：载玻片经过防脱片处理。Nestin、NeuN、GFAP免疫组化步骤：1.石蜡切片进行常规脱蜡、水化：二甲苯Ⅰ10min→二甲苯Ⅱ10min→无水乙醇10min→95％乙醇5min→90％乙醇5min→80％乙醇5min→70％乙醇5min→蒸馏水Ⅰ3-5min→蒸馏水Ⅱ3-5min。2.抗原修复：（1）高温高压抗原修复：取适量的柠檬酸盐缓冲液（PH6.0）于压力锅中（缓冲液的量必须能足够浸没整个切片）放置于电磁炉上加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温染色架上，放入已沸腾的缓冲液中。盖上锅盖扣上压力阀，继续加热至喷汽，扣阀至喷汽以4-6min为佳。时间到，压力锅离开热源。稍置数分钟后，用自来水冲淋使之冷却，去阀开盖，室温放置20min。自然冷却后取出切片。（2）微波抗原修复取适量柠檬酸盐缓冲液（PH6.0）于烧杯中放入微波炉里加热至沸腾，将脱蜡

后置于耐高温切片架上的切片放入沸腾的柠檬酸缓冲液中继续加热10min即可，取出烧杯，室温中通风处放置20～30min。自然冷却后取出切片。3.用0.01MPBS冲洗2-3min→3%H2O2去离子水浸泡10min（以阻断内源性过氧化物酶活性）→PBS冲洗3次，每次5min。4.5％羊血清室温下封闭30分钟。5.甩去羊血清，不洗，直接在切片组织上滴加适量稀释的抗体（Nestin、NeuN、GFAP一抗），置于4℃冰箱过夜。切片置于湿盒中。6.次日上午把切片从冰箱中取出，先在室温中放置30min（以使切片适应室温）。7.0.01MPBS冲洗3次，每次5min。除去PBS（用力甩去）。每张切片上加一滴试剂1（中杉公司的免疫组化试剂盒PV-9000），室温下孵育20min。8.0.01MPBS冲洗3次，每次5min。除去PBS。切片上滴加试剂2（PV-9000），室温下孵育30min。细胞凋亡原位检测的步骤：采用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒1.石蜡切片常规脱蜡至水。2.新鲜配制3%H2O2，室温处理15min。0.01M

PBS液洗涤5min×3次。3.切片上滴加消化液（10mMTris-Hcl

995ul加入1mg/mlProteinaseK新鲜稀释至5ug/ml）,37℃消化20min，0.01MPBS洗5min×3次。4.新鲜配制通透液，4℃孵育20min或室温孵育8min。0.01MPBS洗5min×3次。

通透液：取20XSSC20ul，TritionX-1004ul（45℃-50℃预热），加单蒸水3.98ml，定容至100ml，充分均匀。5.标记甩去切片上多余液体，标本片擦干组织及周边水分，按每张切片滴加1液和2液（1：9，混合均匀）配成TUNEL反应混和液（冰上操作）。阴性对照组只加入试剂2液，而不加1液。标本上覆盖塑料盖片，置样品于湿盒中，37℃标记1h，后4℃过夜。（20h以上）。0.01M

PBS洗5min×3次。6.滴加5%牛血清白蛋白封闭液，室温中30min，甩掉封闭液，不洗。

7.转化剂—POD50μl/片滴加至标本片上。置样品于湿盒中，37℃孵育40min.0.01MPBS洗5min×3次。8.DAB显色，室温5-10min。单蒸水中止显色，流水冲洗10min。9.脱水，透明，封片。八研究工作的主要阶段、进度和完成时间1.实验所需标本已制作完成2.2007.11－2008.1开始做预实验及正式实验3.2008.1－2008.4观察结果，图像分析统计，撰写论文九经费预算1.nestin、NeuN、GFAP三个抗体价格Anti-NeuN：3437.50元（chemicon公司）Anti-nestin：3000元（chemicon公司）Anti-GFAP：3737.50元（Upstate公司）2.免疫组化试剂盒第二代通用型二步法检测系统（北京中杉公司，PV-9000）320.00元/3.0ml3.细胞凋亡原位检测试剂盒（TUNEL）

Roche公司4600元4.封闭用正常羊血清（原液）（北京中杉公司，ZLI－9020）45元/10ml2.实验结果与预期不符这就要求我们从标本固定取材开始直至后续的免疫组化染色和原位凋亡细胞的检测都严格操作，不忽视每一个环节、每一个步骤。试剂准备充分，实验设计合理，实验操作熟练、准确，努力将实验风险控制到最小程度。[5]ConradAM,JeanH,JoanWB.Analysisofthetemporalexpressionofnestininhumanfetalbrainderivedneuronalandglialprogenitorcells[J].DevelopmentalBrainResearch,2002,134(1－2):87-92.[6]VanDcGraaff,KentM.Humatnanatomy.UnitedStatesofAmerica;TheMcGrawHillCompanies,1998.340-345.[7]SulyoklE,VajdaZ,DocziT,etal.Aquaporinsandthecentralnervoussystem.ActaNeurochir,2004,146(9):955-960.[8]朱长庚.神经解剖学.北京:人民卫生出版社，2003.400-407,1033-1046.

[9]BiginiP,BastoneA,MenniniT.Glutamatetransportersinthespinalcordofthewobblermouse[J].Neuroreport，2001.12(9):1815.[10]JCdelaTorre.Alzheimer‘sdisease:howdoesitstart?

JAlzheimersDis，2002,4（6）:497～512.[11]NaruseI,KeinoH.ApoptosisindevelopingCNS.ProgressinNeurobiology，1995,47(2):135～155[12]李泽桂，蔡文琴，陈活彝.神经管发生与程序性细胞死亡.解剖科学进展，1999,5(3)