海南火龙果中蛋白的提取及鉴定

引言火龙果又被叫做仙蜜果、情人果、红龙果，最早在南美洲的热带地区种植，属于仙人掌科三角属多年生多浆植物果实[1-5]。火龙果不仅有很大的参观和赏玩价值，是“花果兼赏，赏食兼用”的绿色园林植物[4]。其果肉又分为白色和红色，红色口味相对较为甜蜜，而白色口感比较清爽。古籍《普济方》记载，火龙果营养价值较高，有促肠排便、降三高和保护视力的作用。因为火龙果中含有花青素这样一种特殊的成分，所以它还具有促进肠胃蠕动、预防贫血、美白皮肤和防黑斑的功效[2]。火龙果集水果、花卉、蔬菜、保健、医药于一体。火龙果果肉及果皮中都富含天然红色素，该天然红色素是一种具有抗增殖活性、抗氧化以及抗菌的生物色素[3]。此外，海南火龙果果肉可用来加工果酱、果酒、果汁和罐头等各种营养保健食品[3,5]。随着科学技术进步以及经济发展，我国南方省份火龙果种植产业持续扩大，已成为多省分特色农业乡村振兴的重要抓手。虽然已有少量关于火龙果中化学成分的活性研究，但是大多数是关于火龙果的种植和培育的研究，对其中含有的蛋白质研究很鲜有。尤其是海南盛产火龙果，很有必要研究其中的生物大分子名称和种类。尽管我国火龙果种植业正处于发展蓬勃期，但当下火龙果副产品加工体系仍处于发展初期，尤其是深入研究火龙果作为水果具有较高营养价值的物质基础很少，因此开展火龙果蛋白质的研究具有良好的应用前景和推广意义[3]。本文通过提取及鉴定火龙果蛋白，旨在为火龙果的药用保健价值及其潜在的保鲜应用提供科学依据，进而提升火龙果深加工的附加值[3]；另外，作为一种海南地道产食用价值很高的水果，研究其所含蛋白可以为深入开发和利用火龙果提供理论依据。对海南热带水果的研究和发展也具有一定的理论和实践意义[1-5]。当然，高效地从本实验样品海南乐东产红心火龙果中提取蛋白是最为关键的一步。现有研究中关于如何提取植物蛋白方法主要是优化后的BPP+酚抽提法、三氯乙酸—丙酮沉淀法以及水溶剂提取法这三种方法[6-9]。其中水溶剂提取法实验操作简洁、蛋白提取率高，但是实验成本较高且实验试剂不稳定也是该方法较为突出的缺点。而三氯乙酸—丙酮沉淀法相对于其他方法来说，提取率和提取蛋白程度均较高，但是该方法操作繁琐且同样存在实验花费较多且试剂不稳定的缺点，因此目前使用该方法的研究较少[6]。传统酚法未在植物蛋白中被大量运用的根本理由就是该方法在植物组织中提取的蛋白质含量很低。而本研究所采用的优化后的BPP+酚提取法相较于传统的酚提取法，可以更有效地从海南乐东产红心火龙果的植物组织中提取到较高质量的蛋白质，不仅能改善提取的效率，还可以减少并降低对蛋白质的破坏且有效缩短提取时间[7]。本实验采用双向凝胶电泳技术来分离并检测提取出的蛋白，该技术也在其他领域中广泛使用[8,13]。凝胶色谱法作为双向电泳技术的基本方法，在实验中发挥重要作用。蛋白分离和解析所使用的凝胶色谱法获得的蛋白图谱具有高分辨度[9]，可高效地对蛋白质进行识别和分析。最后，通过现代质谱技术可得出所提取的海南乐东产红心火龙果的蛋白指纹图谱。生物质谱技术是一种新兴技术，它将现代质谱技术与生物化学的分析方法相结合，利用分子在有机体内的动态分布规律、通过质谱技术对其动态分布进行解析处理，从而对蛋白质定性、定量[11]。该技术还可分析生物体代谢途径中的核酸、脂类、蛋白质等各个阶段生物大分子[12]。本论文的研究选取海南乐东产红心火龙果作为研究对象，通过蛋白质组学技术，依次对海南乐东产红心火龙果进行蛋白提取、蛋白分离并利用MOLDI-TOF-MAS对所获得的海南乐东产红心火龙果蛋白进行相关鉴定。最后，通过搜库比对分析并确定蛋白名称及其种类。2实验部分2.1实验材料、试剂及仪器2.1.1实验药材及制备本实验挑选海南省乐东县（于北纬18°24′至18°58′，东经108°39′至109°24′之间）果实正常发育且形态良好,表面无外伤以及病虫害侵染且成熟期的红心火龙果为实验样品，将样品红心火龙果切碎置研钵中，根据样品重量加入1%PVPP和1%二氧化硅进行研磨，研磨过程中不断加入液氮保持其低温环境。待样品研磨至粉末状之后，将其置于-80°C冰箱中保存备用。2.1.2试剂表SEQ表\*ARABIC1主要试剂试剂名称纯度品牌尿素（Urea）AR上海BBI生命科学苯甲基磺酰氟（PMSF）AR上海BBI生命科学硫脲（Thiourea）BR广东西陇科学3-［3-(胆酰胺丙基)二甲氨基］丙磺内盐(CHAPS)AR北京索莱宝二硫苏糖醇（DTT）BR北京索莱宝碘乙酰胺（IAM）AR上海麦克林过硫酸铵AR上海麦克林三(羟甲基)氨基甲烷（Tris）BR北京索莱宝5×上样缓冲液(5×Loadingbuffer)/北京索莱宝丙烯酰胺BR上海麦克林十二烷基磺酸钠（SDS）AR上海BBI生命科学甘氨酸（GLycine）BR北京索莱宝抗坏血酸BR上海BBI生命科学交联聚乙烯基吡咯烷酮（PVPP）BR上海生工二氧化硅AR上海沪试硼酸钠十水AR上海生工EDTA二钠盐AR上海生工甲叉双丙烯酰胺AR上海麦克林四甲基乙二胺（TEMED）BR北京索莱宝考马斯蓝G-250AR上海BBI生命科学1%溴酚蓝/上海BBI生命科学牛血清蛋白标准品（BSA）BR上海BBI生命科学琼脂糖BR山东西亚硫酸铵AR上海生工蔗糖AR广东西陇科学碳酸氢铵AR上海沪试丙三醇AR上海沪试吐温-20AR北京索莱宝曲拉同X-100AR北京索莱宝正丁醇AR广东西陇科学异丙醇AR广东西陇科学液体石蜡AR广东西陇科学无水甲醇AR广东西陇科学无水乙醇AR广东西陇科学乙酸AR广东西陇科学85%磷酸AR广东西陇科学β-巯基乙醇AR广东西陇科学IMMDrystrippH4-7/美国GEIPGBufferpH3-10/美国GE2.1.3仪器表SEQ表\*ARABIC2主要仪器和设备仪器名称品牌SE600Ruby垂直电泳仪美国GEEttanTMDALTsix电泳槽美国GEMμLtiTempIV水浴恒温循环器美国GEEttanIPGphor3等电聚焦仪美国GEImageScannerⅢ扫描仪美国GEUltraflextremeMOLDI-TOF-MAS质谱仪德国BRUKERSIGMA3-18K超高速离心机德国SIGMASmart-S超纯水仪中国上海和泰EYELA振荡器日本东京理化FDU-2110冻结干燥机日本东京理化HH-G1数显恒温水浴锅中国常州普天仪器制造有限公司PHSJ-3FpH计中国上海仪电TP-214分析天平美国丹佛T6新世纪紫外可见分光光度计中国北京普析通用仪器有限责任公司KQ2200E超声波清洁器中国曙峰企业2.1.4主要溶液配制表SEQ表\*ARABIC3主要溶液配制试剂名称配置方法BPP蛋白提取液TRIS-base

12.1g，EDTA

二钠37.3g，十水硼酸钠19.1g，加500mL超纯水溶解完全。加入8.8g抗坏血酸，300g蔗糖，β

-巯基乙醇20mL和10

mLTriton

X-100

，用Tris-base调节pH至8.0后加水定容到1000mL。AM沉淀剂1000mL甲醇中溶解30g

硫酸铵。Lysis

Buffer蛋白质裂解液8.4g尿素(Urea)

，3.06g硫脲(Thiourea)以及0.4gCHAPS，超纯水定容至10mL。使用前分别加入DTT及PMSF，两种溶液最终浓度为:10μL/mL

PMSF

和10mg/mLDTT。10%过硫酸铵(AP)称取1g过硫酸铵，用超纯水定容至10mL。5%浓缩胶量取30%Acr溶液1.7mL，1.5MpH=6.8的Tris缓冲液1.25mL，超纯水6.85mL，10%SDS溶液0.1mL，10%过硫酸铵溶液0.1mL，现用现配。最后加入0.01mL的TEMED。30%丙烯酰胺(Acr)取适量超纯水加热溶解8g甲叉二丙烯酰胺，再取适量超纯水溶解300g丙烯酰胺。将两份液体合并，超纯水定容至1000mL。10%分离胶量取30%Acr溶液10mL，1.5MpH=8.8的Tris缓冲液7.5mL，超纯水11.9mL，10%SDS溶液0.3mL，10%过硫酸铵溶液0.3mL，现用现配。最后加入0.012mL的TEMED溶液。10电极缓冲液称取Tris30.3g，Gly144g，SDS10g，用超纯水定容至1000mL。Bradford溶液称取100mg的CBB

G250

溶于50mL5%乙醇中，加入85％磷酸100mL，定容至1L，过滤，在4℃环境中贮存。4分离胶贮存液800mL超纯水溶解181.7gTris碱，HCL调节pH至8.8后定容至1000mL。12.5%分离胶量取31.8mL超纯水，25mL4分离胶贮存液，41.7mL30%丙烯酰胺，1mL10%SDS，500μL10%AP，33μLTEMED。现用现配，TEMED以及AP

配制最后加入。溴酚蓝1%100mL超纯水中溶解1g溴酚蓝和0.6gTris。1%琼脂糖封胶液取琼脂糖0.5g和200μL1%

溴酚蓝于100mL1电泳液中加热溶解。平衡缓冲液1.5mol/LpH=8.8的Tris-HCl25mL，180.2g尿素，150mL甘油，10gSDS，1%溴酚蓝1mL，超纯水定容至500mL，-20℃环境下保存。其中，DTT（1%）与IAM（2.5%）于使用前加入。2倍考染液(CBB-A)称取1.25gG250，再依次加入100mL超纯水，300mL无水乙醇和100mL无水甲醇，放置于37℃，r=150rpm的恒温摇床上摇晃1h。考染液CBB-B（避光）称取100g硫酸铵

，用300mL超纯水充分溶解后再加入59mL85%磷酸,定容至500mL。注意：CBB-A摇晃1h之后，再配制CBB-B。凝胶染色时等体积混合CBB-A和CBB-B。凝胶脱色液量取300mL无水乙醇、50mL无水乙酸，混合后超纯水定容至1L。胶粒脱色液100％乙腈50mL和100mmol/L碳酸氢铵50mL混合均匀。基质溶液取7ml乙腈+3ml超纯水+3μLTFA混合均匀后加0.004mgHCCA。2.2实验操作2.2.1海南红心火龙果蛋白的提取称取适量（约100g）海南乐东产红心火龙果肉，分批适量置于预冷研钵中，为防止样品氧化，需根据每份样品的质量，加入1%PVPP和1%二氧化硅进行研磨，研磨过程中不断加入液氮保持其低温环境。将样品研磨至粉末状即可。每3g研磨之后的海南乐东产红心火龙果粉末需加入预冷10mLBPP提取缓冲液，室温涡旋振荡10分钟。之后再加入10mL的Tris饱和酚，再次于室温下涡旋振荡10分钟。设置离心机参数为4°C，16000rpm，离心15分钟，收集离心之后上清液。将上清液与BPP缓冲溶液按照1：2比例混合室温涡旋振荡10分钟。保持离心机参数不变，离心15分钟，收集上清液。将预冷的过饱和硫酸铵甲醇溶液和上清液按照3：1的比例混合，在-20°C条件下过夜沉淀。第二日，可见明显沉淀物。设置离心机参数为4°C，16000rpm，在该条件下离心15分钟，移去上清液。每管中加入1ml冰冷甲醇，将充分充分打碎后的沉淀物混合，保持离心机参数不变离心5分钟，移去上清液，重复此步骤2次。再向其中加入0.5ml冰冷丙酮[7，14]，将蛋白块尽量搅碎，保持离心机参数不变，离心5分钟，弃上清，重复2次。室温风干蛋白沉淀，加适量蛋白裂解液，蛋白沉淀22°C溶解4-5个小时。20°C，18000rpm的条件下将溶解完全的蛋白液离心30分钟，转移蛋白溶液，放置于冰箱下层，-20℃保存。2.2.2蛋白质的定量配制梯度浓度分别为0、2、4、6、8、10μg/ml的牛血清蛋白储备液。根据Bradford法[16]，在595nm处用紫外分光光度法测定吸收值，做标准曲线方程。取3μL待测海南乐东产红心火龙果蛋白样品测定紫外吸光度值，重复三次，取平均值。根据实验结果测得蛋白浓度，以便进行后续电泳实验。2.2.3单向聚丙烯酰胺凝胶电泳组装配件，灌注10%分离胶至合适体积，用1mL正丁醇压胶，静置过夜。次日上午，倒掉正丁醇，灌注5%浓缩胶至溢出，快速插入梳子，静置1小时以上。拔出梳子后，加入1×电泳缓冲液。上样前将5xloadingbuffer和蛋白样品按照4:1比例混合水浴煮沸5分钟。每孔中依次加入稀释后的样品（2ug/uL），对照品与实验品的浓度梯度需一致（20ul40ul60ul80ul），样品泳道一侧加入彩虹marker5uL，然后在两侧各加入10uL5xloadingbuffer。电源设置5w/片，开始进行蛋白浓缩，约1小时。待样品至上下胶分界线之后，电源设置7w/片，开始进行蛋白分离至结束。凝胶室温下染色摇床过夜。染色完成后，重复3次脱色，每次40分钟。脱色完成后，将凝胶转移1L7%乙酸（凝胶保存液）中放置1小时左右，重复两次至背景干净。使用ImageScannerIII扫描仪扫描脱色完成后的单向凝胶图谱，将获得的图像保存备用。2.2.4双向聚丙烯酰胺凝胶电泳水化上样和第一向等点聚焦（IEF）在一次性水化盘内采用胶内水化的方式上样，上样前要提前半小时从冰箱中拿出四张NLpH4~7的24cmIPG胶条。每条水化槽道中加445μL蛋白样品＋蛋白裂解液和5μLIPGbuffer后，再缓慢覆盖住NLpH4~7的24cmIPG胶条，再加入5ml液体石蜡铺满水化槽道，覆盖住胶条。450μL上样体积中蛋白量应为1.3mg。20°C恒温水化18h。水化结束后，开始等电聚焦。聚焦极限电流为50μA/胶条，聚焦环境温度为20°C。具体参数如下：StepUVTIME12503h25002h310003h430002h5800014h610001h胶条平衡等点聚焦结束后，胶条依次在DTT和碘乙酰胺两种平衡缓冲液中进行平衡，每次15分钟，各平衡两次。SDS（双向垂直电泳）使用12.5%分离胶进行双向垂直电泳。仔细将平衡后胶条转移至双向垂直板胶的上端，用琼脂糖封胶以便固定住胶条。在双向电泳仪中加1x电泳缓冲液。设置电泳参数设置为1W/gel，循环水浴温度为16°C，1小时后改变电泳参数为13W/gel至电泳结束。凝胶染色和脱色电泳结束之后，将凝胶室温染色摇床过夜。之后，脱色液脱色40分钟，重复三次。最后将凝胶转移至保存液中1小时。凝胶扫描和图像分析扫描双向凝胶图谱。300dpi投射扫描，用ImageMaster5.0图像分析软件对图像进行分析，查找差异蛋白点。胶内酶解参照凝胶分析的结果找出四张凝胶上各个蛋白点的相对位置，修剪枪头至适配各蛋白点的大小进行挖点，将多次挖点后的蛋白点汇总至新的离心管中，每个蛋白点都需要更换新的离心管和枪头。将挖点之后的凝胶图打印保存。在离心管上写好标签，于-86°C冰箱保存备用。2.2.5质谱鉴定胶粒脱色之后再进行酶解。胶粒脱色的具体步骤如下：在盛有蛋白点的离心管中加入150μL超纯水，设置摇床参数为150rpm，震荡30分钟。震荡结束后，直接吸去超纯水并再加入150μL超纯水按照上述参数震荡，重复三次。之后，将较大的凝胶颗粒捣碎至米粒大小，加入200μL胶粒脱色液，设置摇床参数为150rpm，震荡30分钟。同样重复以上操作3次，直至胶粒变为无色透明状。再加入200μL超纯水，摇床150rpm震荡10分钟，重复三次，该过程是为去除样品中的NH4HCO3，否则质谱鉴定结果可能会受到残留的盐离子的影响。胶粒在200uL100%ACN中脱色15分钟，重复上述操作直至胶粒变为硬的、纯白色颗粒。最后一次操作时直接吸去ACN，将离心管封口，在-86°C冰箱保存备用。酶解。向胶粒中加入恰好漫过其的胰蛋白酶，之后在4°C条件下放置60分钟，再加入略微超出胶粒的酶解液，将其放置于摇床上，37°C酶解蛋白13小时。将酶解后胶粒常温离心10分钟，收集酶解液用于质谱鉴定。在离心管上做好标记并放置于-20℃的冰箱中保存。点样（三步法）：首先取1μL基质液于点样板上，晾干；然后取3μL样品酶解液于点样板上等待其晾干；最后再在晾干的样品上点取1μL基质液，静待其阴干。点样结束后，采用MOLDI-TOF-MAS对海南乐东产红心火龙果样品中的蛋白进行质谱鉴定。测试前需进行校正。通过BioTool软件将所获得的海南乐东产红心火龙果蛋白质谱数据进行分析，将肽质量指纹谱数据提交到蛋白质数据库中进行搜库比对，以便确定海南乐东产红心火龙果中蛋白的生物分类、名称、相对分子质量、得分、等电点以及覆盖率等相关信息。3结果与讨论3.1蛋白质定量分析利用Bradford法[15]对海南火龙果中的蛋白质进行定量检测，绘制标准曲线，其中纵坐标为对应的吸光度，横坐标为BSA的浓度。见图1，曲线方程为y=0.83462+0.14443x，R2为0.99407，符合测定要求。得出海南乐东产红心火龙果样品中的平均蛋白浓度为12.765μg/mL。图SEQ图\*ARABIC1牛血清标准蛋白曲线3.2单向凝胶电泳分析图SEQ图\*ARABIC2海南火龙果单向电泳图判断所提取的海南乐东产红心火龙果中蛋白质是否降解或者变性可以通过单向凝胶电泳来检测。单向电泳图中结果显示，蛋白条带随着上样量的递增，愈发丰富、明显；样品蛋白条带数量多且清晰。由此推断所提取的海南乐东产红心火龙果蛋白没有变性且未降解，其所含的高丰度蛋白较少，可开展进一步实验。由海南火龙果单向电泳图可得该样品火龙果蛋白的分子量在33kDa左右主要集中。3.3双向凝胶电泳分析本试验选用固相pH胶条（IPG，24cm，pH=4~7），利用优化后的BPP+酚抽提法去除植物的高丰度蛋白，除去多种杂质[17]，获得海南乐东产红心火龙果的蛋白指纹图谱（图3）。其中高表达蛋白点为78个,编号已在图A中标出。图SEQ图\*ARABIC3海南火龙果果2-DE电泳图谱（A图已标记，B、C、D均为重复结果）3.4生物质谱搜库分析将所得的质谱数据通过BRUKER仪器专用软件FlexAnalysis及Biotool软件分析，最后将一级与二级肽质谱数据提交到数据库中搜库比对，得到蛋白质的名称和种类[16]，见表4。可确定海南乐东产红心火龙果蛋白47个，其来源真菌、植物、其他生物和细菌四个不同的种类。表SEQ表\*ARABIC4海南火龙果蛋白鉴定结果汇总蛋白编号Proteinnumber蛋白质名称Proteinname相对分子质量Monoisotopicmass等电点PI得分Score覆盖率（%）Coverage（%）NCBI生物分类Taxonomy1主要过敏原I多肽链2MajorallergenIpolypeptidechain2120174.821116猫头鹰Feliscatus2核帽结合蛋白亚基2Nuclearcap-bindingproteinsubunit2210138.871910裂殖酵母pombe972h-Schizosaccharomycespombe972h3感觉视紫红质IIISensoryrhodopsinIII250689.6578HaloarculamarismortuiATCC430494VpX5'区中未表征的蛋白质UncharacterizedproteininVpX5'region(Fragment)53089.821843乳酸脱氢酶升高病毒Lactatedehydrogenase-elevatingvirus6肌红蛋白Myoglobin154438.702235鲣鱼Katsuwonuspelamis7腺苷钴酰胺-GDP利巴唑转移酶Adenosylcobinamide-GDPribazoletransferase264339.261921富马氧化物同旋杆菌SyntrophobacterfumaroxidansMPOB8NADH-醌氧化还原酶亚基KNADH-quinoneoxidoreductasesubunitK110796.542526富营养亚硝化单胞菌C91NitrosomonaseutrophaC919Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂superbin-2Kunitz-typeserineproteaseinhibitorsuperbin-295228.252660铜班蛇Austrelapssuperbus10光系统I反应中心亚基XIIPhotosystemIreactioncentersubunitXII34004.541978球毛球藻Chaetosphaeridiumglobosum11推定金属硫蛋白MT1DPPutativemetallothioneinMT1DP58348.372640人Homosapiens13减数分裂抑制剂蛋白1Meiosisinhibitorprotein11428956.24101人Homosapiens14ATP合酶ε链ATPsynthaseepsilonchain148574.852821牡蛎希瓦氏菌ATCC700345ShewanellapealeanaATCC70034516芋螺毒素VnMSGL-0122ConotoxinVnMSGL-012290258.293940地中海芋螺Conusventricosus19脂蛋白信号肽酶Lipoproteinsignalpeptidase189808.073639生防假单胞菌Pf-5PseudomonasprotegensPf-520乙酰辅酶A羧化酶羧基转移酶亚基αAcetyl-coenzymeAcarboxylasecarboxyltransferasesubunitalpha353495.762825志贺氏菌CDC3083-94ShigellaboydiiCDC3083-9423Na（+）-易位NADH-醌还原酶亚基DNa(+)-translocatingNADH-quinonereductasesubunitD227518.952735坎贝尔弧菌BAA-1116型VibriocampbelliiATCCBAA-111626自噬相关蛋白2Autophagy-relatedprotein22129605.2971新型隐球菌变种B-3501ACryptococcusneoformansvar.neoformansB-3501A27转录因子JUNGBRUNNEN1TranscriptionfactorJUNGBRUNNEN1316658.24246拟南芥Arabidopsisthaliana28伴侣蛋白GroEL60kDachaperonin575075.0983日光细菌HeliobacteriummodesticaldumIce129金属硫蛋白Metallothionein75978.382657绿头鸭Anasplatyrhynchos30金属硫蛋白Metallothionein71718.051930北方须鳅Barbatulabarbatula33ATP磷酸核糖基转移酶ATPphosphoribosyltransferase238436.981111新鞘鲷NovosphingobiumaromaticivoransDSM1244434光系统II反应中心蛋白YPhotosystemIIproteinY387911.723371颗石藻Emilianiahuxleyi36未表征蛋白YitQUncharacterizedproteinYitQ220398.64511枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌亚种subtilisstr.168Bacillussubtilissubsp.subtilisstr.16838乙酸激酶Acetatekinase437686.123322拟杆菌thetaiotaomicronVPI-5482BacteroidesthetaiotaomicronVPI-548241金属硫蛋白-1EMetallothionein-1E71508.382044人Homosapiens42金属硫蛋白-1AMetallothionein-1A72398.383352穴兔Oryctolaguscuniculus43小核糖体亚基蛋白bS2030SribosomalproteinS20946611.182031嗜冷黄杆菌JIP02/86FlavobacteriumpsychrophilumJIP02/8645ATP合酶蛋白8ATPsynthaseprotein865846.703650斑马鱼Daniorerio46ATP合酶蛋白8ATPsynthaseprotein865846.703650斑马鱼Daniorerio47DNA定向RNA聚合酶亚基Rpo12DNA-directedRNApolymerasesubunitP52889.341223古菌DSM4304ArchaeoglobusfulgidusDSM43044945kDa细胞壁蛋白45kDacellwallprotein(Fragment)16348.591480菜豆Phaseolusvulgaris5145kDa细胞壁蛋白45kDacellwallprotein(Fragment)16348.591480菜豆Phaseolusvulgaris53核糖体RNA小亚基甲基转移酶HRibosomalRNAsmallsubunitmethyltransferaseH353035.76134嗜碱菌OhILAsAlkaliphilusoremlandiiOhILAs54细胞分裂拓扑特异性因子Celldivisiontopologicalspecificityfactor115409.611720核梭杆菌核亚种ATCC25586Fusobacteriumnucleatumsubsp.nucleatumATCC2558655钾通道毒素α-KTx14.1Potassiumchanneltoxinalpha-KTx14.161718.583018马氏正钳蝎Mesobuthusmartensii58鸟苷酸激酶Guanylatekinase233285.1475GeobactersulfurreducensPCA59碱性磷脂酶A2BasicphospholipaseA2APL-D49165758.613533食鱼蝮Agkistrodonpiscivorusleucostoma60大核糖体亚基蛋白uL29c50SribosomalproteinL29,chloroplastic79379.741316细基江蓠繁枝变种Gracilariatenuistipitatavar.liui62大核糖体亚基蛋白uL1150SribosomalproteinL11147119.302824海洋原绿球菌NATL1AProchlorococcusmarinusstr.NATL1A63未表征蛋白MJ0766UncharacterizedproteinMJ076674589.271828詹氏甲烷球菌MethanocaldococcusjannaschiiDSM266165乳清酸磷酸核糖基转移酶Orotatephosphoribosyltransferase209795.673120ChlorobiumphaeovibrioidesDSM26568天冬氨酸转氨酶，细胞质Aspartateaminotransferase,cytoplasmic462578.4672 酿酒酵母S288cSaccharomycescerevisiaeS288C74大核糖体亚基蛋白uL250SribosomalproteinL23042410.6266海杆菌HTE831型OceanobacillusiheyensisHTE83175Coldshockdomain-containingprotein4194086.292218拟南芥Arabidopsisthaliana76金属硫蛋白Metallothionein71618.383255弓头鲸Balaenamysticetus77甲基-5'-硫代腺苷磷酸化酶S-methyl-5'-thioadenosinephosphorylase313236.31237玻璃海鞘Cionaintestinalis3.5海南火龙果蛋白的功能分析对海南火龙果的蛋白进行分析鉴定后，利用生物信息学的方法，分析了海南火龙果蛋白的功能，结果如表4所示。从表4可看出，在海南火龙果蛋白中，2号蛋白参与了核mRNA的成熟、输出和降解；6号蛋白可以储存氧气并促进其扩散还可以保护细胞免受活性氧的侵害；9号蛋白是丝氨酸蛋白酶的抑制剂；11、29、30、41、42号蛋白含有高含量的半胱氨酸残基，可以结合各种重金属；13号蛋白为正常减数分裂染色体突触所必须的蛋白；19、34、45、46号蛋白均可参与产生ATP；26号蛋白在细胞膜的扩增中发挥了一定作用；28号蛋白在协助蛋白质折叠方面起到了至关重要的作用；33号蛋白在催化ATP等途径中同样起到了至关重要的作用；38号蛋白具有多种催化能力；54号蛋白参与了细胞的分裂；55号蛋白是钾通道的潜在阻断剂；58号蛋白则对于回收GMP以及间接回收cGMP至关重要；68号蛋白在氨基酸代谢中起关键作用。其中ATP合酶蛋白（45、46号）主要涉及火龙果的生长、发育等多种功能。表SEQ表\*ARABIC5海南火龙果蛋白功能分析蛋白编号Proteinnumber蛋白质名称Proteinname生物学功能Biologicalfunction2核帽结合蛋白亚基2Nuclearcap-bindingproteinsubunit2CBC复合物的组分，其与前mRNA的5'帽共转录结合，并参与核mRNA的成熟、输出和降解[17]。3感觉视紫红质IIISensoryrhodopsinIII感觉视紫红质。与一种不寻常的换能器相关联，该换能器缺乏在所有其他光感换能器中发现的甲基接受换能器结构域[18]。6肌红蛋白Myoglobin单体血红素蛋白，其主要功能是储存氧气并促进其在肌肉组织内的扩散。通过五配位的血红素铁可逆地结合氧气，并在需求增加期间根据需要及时有效地释放氧气。根据组织和细胞的氧化条件，除了结合氧气的能力外，它还具有亚硝酸盐还原酶活性，从而调节生物活性一氧化氮的产生。在缺氧和缺氧等应激条件下，由于其假过氧化物酶活性，它还可以保护细胞免受活性氧的侵害[19]。7腺苷钴酰胺-GDP利巴唑转移酶Adenosylcobinamide-GDPribazoletransferase加入腺苷钴酰胺-GDP和α-利巴唑生成腺苷钴胺素（Ado-cobalamin）。还从腺苷钴酰胺-GDP和α-核唑5'-磷酸合成腺苷钴胺素5'-磷酸[20]。8NADH-醌氧化还原酶亚基KNADH-quinoneoxidoreductasesubunitK此蛋白可电子从NADH中转移到呼吸链中的醌。还可将氧化还原反应与质子易位偶联，并因此在质子梯度中保守氧化还原能量[21]。9Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂superbin-2Kunitz-typeserineproteaseinhibitorsuperbin-2丝氨酸蛋白酶抑制剂。13减数分裂抑制剂蛋白1Meiosisinhibitorprotein1正常减数分裂染色体突触所必需。可能参与精母细胞减数分裂双链断裂（DSB）的形成（通过相似性）[22]。14ATP合酶ε链ATPsynthaseepsilonchain在膜上存在质子梯度的情况下从ADP产生ATP[23]。19脂蛋白信号肽酶Lipoproteinsignalpeptidase这种蛋白质特异性催化从原脂蛋白中去除信号肽[24]。20乙酰辅酶A羧化酶羧基转移酶亚基αAcetyl-coenzymeAcarboxylasecarboxyltransferasesubunitalpha乙酰辅酶A羧化酶（ACC）复合物的组分。生物素羧化酶催化生物素首先在其BCCP上进行羧化，然后CO2基团被羧基转移酶转移到乙酰辅酶A，由此形成丙二酰辅酶A[25]。23Na（+）-易位NADH-醌还原酶亚基DNa(+)-translocatingNADH-quinonereductasesubunitDNQR复合物通过两个连续的反应催化泛醌-1还原为泛醇，同时将Na离子从细胞质转运到周质。NqrA到NqrE可能涉及第二步，即泛西醌转化为泛醇[26]。26自噬相关蛋白2Autophagy-relatedprotein2自噬体完成和过氧化物酶体降解所需的脂质转移蛋白。将分离膜（IM）的边缘拴在内质网（ER）上，并介导脂质从ER到IM的直接转移以进行IM扩增。ATG2与其N端区域（NR）中的碱性残基结合内质网出口位点（ERES），后者是自噬体形成的膜源，并通过其C端区域与IM的扩展边缘结合。后者的结合由ATG18-PtdIns3P相互作用辅助。然后，ATG2使用其NR从膜源中提取磷脂，并通过其预测的富含β折叠的结构将它们转移到ATG9到IM，用于膜扩增[27]。28伴侣蛋白GroEL60kDachaperonin与其共伴侣蛋白GroES一起，在协助蛋白质折叠方面起着至关重要的作用。GroEL-GroES系统形成一个纳米笼，允许封装非天然底物蛋白，并提供优化的物理环境，以促进和加速蛋白质折叠[28]。29，30，41，42，76金属硫蛋白Metallothionein金属硫蛋白含有高含量的半胱氨酸残基，可结合各种重金属[29]。33ATP磷酸核糖基转移酶ATPphosphoribosyltransferase催化ATP和5-磷酸核糖1-二磷酸缩合形成N'-（5'-磷酸核糖基）-ATP（PR-ATP）。在该途径中起着至关重要的作用，因为组氨酸生物合成的速率似乎主要由调节HisG酶活性来控制[30]。34光系统II反应中心蛋白YPhotosystemIIproteinY它是光系统II（PSII）核心的松散结合成分，并不总是在晶体中看到。PSII是一种光驱动的水质体醌氧化还原酶，利用光能从H中提取电子2O，产生质子梯度，随后用于ATP的形成[31]。38乙酸激酶Acetatekinase催化乙酸酯和ATP形成乙酰磷酸酯。还能催化逆反应[32]。43小核糖体亚基蛋白bS2030SribosomalproteinS20直接与16S核糖体RNA结合[33]。45，46ATP合酶蛋白8ATPsynthaseprotein8线粒体膜ATP合成酶，在膜上质子梯度存在的情况下由ADP生成ATPF型ATP酶由膜质子通道组成。在催化过程中，在F的催化域中合成ATP1通过中央茎亚基的旋转机制与质子易位耦合。[34]。47DNA定向RNA聚合酶亚基Rpo12DNA-directedRNApolymerasesubunitPDNA依赖性RNA聚合酶（RNAP）催化DNA转录为RNA[35]。53核糖体RNA小亚基甲基转移酶HRibosomalRNAsmallsubunitmethyltransferaseH特异性甲基化胞苷在16SrRNA的1402（C1402）位的N4位[36]。54细胞分裂拓扑特异性因子Celldivisiontopologicalspecificityfactor防止蛋白质MinC和MinD在内部分裂位点抑制细胞分裂，同时允许在极性位点进行抑制。这通过限制在细胞长轴中点形成分裂隔膜来确保细胞在适当的部位分裂[37]。55钾通道毒素α-KTx14.1Potassiumchanneltoxinalpha-KTx14.1钾通道的潜在阻断剂[38]。58鸟苷酸激酶Guanylatekinase对于回收GMP和间接回收cGMP至关重要[39]。59碱性磷脂酶A2BasicphospholipaseA2APL-D49PLA2催化3-sn-磷酸甘油酯中2-酰基的钙依赖性水解。在肌肉注射小鼠模型中诱导局部和全身肌毒性。在小鼠脚垫测定中诱导局部水肿。不具有任何抗凝作用。不介导对革兰氏阴性和革兰氏阳性菌的抗菌作用[40]。62大核糖体亚基蛋白uL1150SribosomalproteinL11形成核糖体柄的一部分，帮助核糖体与GTP结合的翻译因子相互作用[41]。65乳清酸磷酸核糖基转移酶Orotatephosphoribosyltransferase催化核糖基磷酸基团从5-磷酸核糖1-二磷酸转移到乳清酸，导致奥罗替丁一磷酸（OMP）的形成[42]。68天冬氨酸转氨酶，细胞质Aspartateaminotransferase,cytoplasmic在氨基酸代谢中起关键作用[43]。74大核糖体亚基蛋白uL250SribosomalproteinL2主要的rRNA结合蛋白之一。需要30S和50S亚基结合以形成70S核糖体，用于tRNA结合和肽键形成。有人认为它具有肽基转移酶活性;这有点争议。与16S核糖体中的70SrRNA进行多次接触[44]。75Coldshockdomain-containingprotein4与RNA、单链（ssDNA）和双链（dsDNA）DNA结合并解开核酸双链体的伴侣。表现出DNA熔解活性。可能涉及耐寒性。防止种子在脱水或盐胁迫条件下发芽[45]。77甲基-5'-硫代腺苷磷酸化酶S-methyl-5'-thioadenosinephosphorylase催化S-甲基-5'-硫代腺苷（MTA）可逆磷酸化为腺嘌呤和5-甲基硫代核糖-1-磷酸。参与MTA的分解，MTA是多胺生物合成的主要副产物。负责从S-腺苷甲硫氨酸产生MTA后蛋氨酸挽救途径的第一步。以6-氨基嘌呤核苷为首选底物，具有广泛的底物特异性[46]。4结论本研究通过BPP+酚抽提法、双向凝胶电泳以及生物质谱鉴定等方法提取并鉴定海南乐东产红心火龙果中的植物蛋白，得出以下结论：海南乐东产红心火龙果蛋白的分子量在33KD左右主要集中，生物质谱鉴定出有47个蛋白，涉及火龙果的生长、发育、代谢、增殖和抗逆等多种生理功能。本研究所得火龙果蛋白种类可以为深入开发和利用海南火龙果提供理论依据，同时对研究其他海南热带水果的研究和发展也具有一定的指导意义。

参考文献宋珊珊，谭沙，蔡国跃，等火龙果果皮色素提取工艺及稳定性研究[J].食品与机械，2013，29(02)：121-125.云春艳.石榴红心火龙果复合饮料的工艺研究[J].轻工科技，2019，35(06)：5-7.林润婷，梁家嘉，莫雨杏，等.火龙果果皮红色素抑菌活性及对鳙鱼肉新鲜度的指示效应[J/OL].食品工业科技:1-18[2024-04-13].牛德宝,叶鸿儒,冯小芹,等.火龙果主要生物活性成分及其功能特性研究进展[J].广西科学院学报,2024,40(01):9-20..王文平,杨爱珍.苔藓植物双向凝胶电泳蛋白样品制备的优化[J].北京农学院学报,2014,29(04):8-11.吕潇,张晓倩,王聿双,等.向日葵幼苗全蛋白提取及双向电泳技术体系的建立[J].分子植物育种,2015,13(11):2599-2603.张译元,唐红,郭延华,等.绵羊血清蛋白双向凝胶电泳技术的建立[J].新疆农业科学,2017,54(01):190-196.刘嘉,李冬,王徐,等.蛋白质组学的研究进展[J].现代医药卫生,2019,35(09):1380-1384.刘淑芹,吴凤芝.分蘖洋葱叶片总蛋白提取与双向电泳条件优化[J].东北农业大学学报,2013,44(01):71-76.代莉莉.基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析合成聚合物样品制备的研究进展[J].分析测试技术与仪器,2022,28(04):375-383.金萍,叶湖,丁洪流,等.基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法提取阳澄湖全谱图范围内大闸蟹蛋白条件优化[J].食品安全质量检测学报,2022,13(01):56-64.姜兴旭,陈发河.莲雾果实高质量总蛋白提取方法的建立[J].黑龙江科学,2017,8(08):84-85.于松,高庆荣,袁凯,等.小麦幼穗蛋白质双向电泳条件的优化[J].基因组学与应用生物学,2012,31(01):84-89.方寅飞,吴朝霞,何思颖,等.基质辅助激光解析电离飞行时间质谱快速检测产KPC型肺炎克雷伯菌[J].中国卫生检验杂志,2023,33(06):675-678.王孝平,邢树礼.考马斯亮蓝法测定蛋白含量的研究[J].天津化工,2009,(3):40-42.宋媛.Pb2+、Cd2+胁迫下海南木榄叶的差异蛋白质组学及其与DNA作用的研究[D].海南师范大学,2024.WoodV,GwilliamR,RajandreamMA,etal.ThegenomesequenceofSchizosaccharomycespombe.Nature.2002,415(6874):871-80.FuHY,LinYC,ChangYN,TsengH,etal.Anovelsix-rhodopsinsysteminasinglearchaeon.JBacteriol.2010,192(22):5866-73.HofbauerS,PignataroM,BorsariM,etal.Pseudoperoxidaseactivity,conformationalstability,andaggregationpropensityoftheHis98Tyrmyoglobinvariant:implicationsfortheonsetofmyoglobinopathy.FEBSJ.2022,289(4):1105-1117.CameronB,BlancheF,RouyezMC,etal.Geneticanalysis,nucleotidesequence,andproductsoftwoPseudomonasdenitrificanscobgenesencodingnicotinate-nucleotide:dimethylbenzimidazolephosphoribosyltransferaseandcobalamin(5'-phosphate)synthase.JBacteriol.1991,173(19):6066-73.SteinLY,ArpDJ,BerubePM,etal.Whole-genomeanalysisoftheammonia-oxidizingbacterium,NitrosomonaseutrophaC91:implicationsfornicheadaptation.EnvironMicrobiol.2007,9(12):2993-3007.LibbyBJ,ReinholdtLG,SchimentiJC.PositionalcloningandcharacterizationofMei1,avertebrate-specificgenerequiredfornormalmeioticchromosomesynapsisinmice.ProcNatlAcadSciUSA.2003,100(26):15706-11.WalkerJE,GayNJ,SarasteM,etal.DNAsequencearoundtheEscherichiacoliuncoperon.Completionofthesequenceofa17kilobasesegmentcontainingasnA,oriC,unc,glmSandphoS.BiochemJ.1984,224(3):799-815.PaulsenIT,PressCM,RavelJ,etal.CompletegenomesequenceoftheplantcommensalPseudomonasfluorescensPf-5.NatBiotechnol.2005,23(7):873-8.RaskoDA,RosovitzMJ,MyersGS,etal.ThepangenomestructureofEscherichiacoli:comparativegenomicanalysisofE.colicommensalandpathogenicisolates.JBacteriol.2008,190(20):6881-93.ZhouW,BertsovaYV,FengB,etal.SequencingandpreliminarycharacterizationoftheNa+-translocatingNADH:ubiquinoneoxidoreductasefromVibrioharveyi.Biochemistry.1999,38(49):16246-52.TsukadaM,OhsumiY.Isolationandcharacterizationofautophagy-defectivemutantsofSaccharomycescerevisiae.FEBSLett.1993,333(1-2):169-74.SampsonJS,O'ConnorSP,HollowayBP,etal.NucleotidesequenceofhtpB,theLegionellapneumophilageneencodingthe58-kilodalton(kDa)commonantigen,formerlydesignatedthe60-kDacommonantigen.InfectImmun.1990,58(9):3154-7.MesserleBA,SchäfferA,VasákM,etal.Three-dimensionalstructureofhuman[113Cd7]metallothionein-2insolutiondeterminedbynuclearmagneticresonancespectroscopy.JMolBiol.1990,214(3):765-79.KrauseA,RamakumarA,BartelsD,etal.Completegenomeofthemutualistic,N2-fixinggrassendophyteAzoarcussp.strainBH72.NatBiotechnol.2006,24(11):1385-91.NakamuraY,KanekoT,SatoS,etal.CompletegenomestructureofthethermophiliccyanobacteriumThermosynechococcuselongatusBP-1.DNARes.2002,9(4):123-30.McClellandM,SandersonKE,SpiethJ,etal.CompletegenomesequenceofSalmonellaentericaserovarTyphimuriumLT2.Nature.2001,413(6858):852-6.LarimerFW,ChainP,HauserL,etal.CompletegenomesequenceofthemetabolicallyversatilephotosyntheticbacteriumRhodopseudomonaspalustris.NatBiotechnol.2004,22(1):55-61.BroughtonRE,MilamJE,RoeBA.Thecompletesequenceofthezebrafish(Daniorerio)mitochondrialgenomeandevolutionarypatternsinvertebratem