DB50T 459-2012 草鱼出血病检疫技术规范

备案号：34907-2012DB50DB50/T459—2012草鱼出血病检疫技术规范Thenormoftechniqueforhemorrhagediseaseofgrasscarp2012-09-01发布2012-12-01实施重庆市质量技术监督局发布I 12规范性引用文件 13术语和定义 14检疫方法 15无害化处理 3 4 5 6 800本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准的附录A、附录B、附录C、附录D为规范性附录。本标准由重庆市农业委员会提出并归口。本标准起草单位：重庆市鱼病防治监测中心、重庆市水产学会。本标准主要起草人：梅会清、李虹、曹豫、陈畅、陈玉露、翟旭亮、袁建明、宋关碧、鲍洪波、邓婕。1本标准规定了草鱼出血病检疫技术规范的术下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括是有的修改单)适用于本标准。DB50/T339水生动物检疫技术规范3术语和定义由草鱼出血病病毒引起的鱼病。主要危害草鱼、青鱼。主要症状为病鱼肌肉、肠道、鳍及鳃草鱼出血病病毒GrassCarpHemorrhageVirus简称GCHV,隶属水生呼肠孤病毒属(Aguareovirus)。4检疫方法4.1临床检查4.1.1检查方法4.1.1.1免疫核实经核实检疫对象(草鱼、青鱼，下同)已按规定接种了合格的草鱼出血病疫苗，并处在免疫4.1.1.2群体检查24.1.1.3个体检查4.1.2检查内容群体中若有离群独游、翻白、浮头、活力差、摄食能力不强、逃避反应弱、外观缺损和色泽4.1.2.2个体检查外观检查：观察体色、体态和鱼体不同部位的变化情况，检疫样本出现下列症状的疑似草鱼c)体表：口腔、上下颌、头顶部、眼眶周围、鳃盖、鳃及鳍条基部和腹部充血、出血，这时解剖检查：解剖后检查皮下肌肉和内脏器官的变化情况，检疫对象出现下列症状的可判定为a)皮下肌肉：剥开皮肤，肌肉呈点状或块状充血、出血，严重时全身肌肉呈少；肠系膜、周围脂肪、鳔、胆囊、肝、肾有出血点或血丝；个别病4.1.3临床检查判断群体检查和个体检查中发现有草鱼出血病的全部或部分症状，可作疑似草鱼出血病对待，即4.2流行病学调查如发现疑似草鱼出血病病例，应进行草鱼出血病流行病学调查，按附录A的要求执行。4.3实验室确诊4.3.1病理学检查3午取经临床检查判断为疑似草鱼出血病患病鱼的新鲜组织，通过固定、作石蜡切片、午用生物显微镜观察。同时，对检疫对象的血液进行显微镜检查。根据下列病理变化，可诊断为草a)早期肠上皮细胞肿胀，杯状细胞略有增加，固有层充血、出血，肠上皮与固有层剥离，粘膜下层也轻度充血；病变严重时肠上皮几乎完全脱落，固有层级粘膜下层大量出血，肌层也有出血，肠腔中有大量红细胞、成片的肠上皮、纤维素样物质病变早期为少。b)各脏器小血管管壁广泛受损，毛细血管扩张充血，内皮细胞肿胀、坏死；形成微血栓和血液淤滞，正常代谢发生障碍，脏器组织梗死样病变。c)肝细胞发生颗粒变性、水样变性、胞浆中糖原减少或消失，有些肝细胞的胞浆内可看到嗜酸性包涵体；严重时，肝细胞发生核溶解等细胞坏死。d)红细胞数、白细胞数显著低于健康鱼。白细胞中，淋巴细胞百分率显著低于健康鱼，而中性粒细胞百分率则显著高于健康鱼。经初步判断为疑似草鱼出血病的患病草鱼，取其肝、肾、脾、肠、肌肉、血管等组织制作超薄切片，用透射电子显微镜观察。如在电子显微镜下观察到草鱼出血病病毒粒子，可确诊为草鱼出血病。草鱼出血病病原为草鱼出血病病毒(Grasscarphemorrhagevirus,GCHV)。病毒为20面体和5:3:2对称的球型颗粒，直径为65nm-72nm,具双层衣壳、无囊膜、外周为20个壳粒，核心直径在50nm左右。经初步判断为疑似草鱼出血病的患病鱼，采用下述方法之一确诊。4.3.3.1斑点酶联免疫吸附试验(Dot-E4.3.3.2葡萄球菌A蛋白协同凝集试验(SPA-COA),按附录C的要求执行。4.3.3.3逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测，按附录D的要求执行。5无害化处理禁止患病鱼异地(塘)转移或上市，对病死鱼实施无害化处理，处理方法按DB50/T339水生动物检疫技术规范的要求执行。4(规范性附录)调查内容免疫接种是否接种了草鱼出血病疫苗，免疫程序是否规范。步排除草鱼出血病。易感品种易感年龄主要是二龄以下草鱼种易患草鱼出血病，二龄及二龄以上草鱼基本上不患草鱼出血病。病。流行季节一般6月～9月，8月为草鱼出血病流行高峰期。水温在20℃~33℃时发生草鱼出血病流行，流行的最适水温为27℃~30℃:当池塘水质恶化，则在水温20℃以下及33℃以上时也有发病。如果水温在20℃~33℃时患病草鱼出现典型质好，水温在20℃以下、33℃以上患病草鱼出现典型出血症状，可排除草鱼出血病鱼病防治是否使用消毒药物进行草鱼病的防治血病。根据水产养殖病害测报结果，确定产地是否为草鱼出血病疫区。5附录B(规范性附录)斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)GCHV毒种取自典型自然发病的出血病病鱼组织，用蔗外分光光度吸收法测定纯度，并按Farrel等"的9.10D参照闵淑琴等²方法免疫大白兔，琼脂双向扩散法测定抗血清效价，待滴度达到1:256左右，从颈动脉采血制备血清，经(NH₄)₂SO₄沉淀后用DEAE-SephadexA50柱层析法提纯IgG,紫外分光光取肝脏、肾脏、脾脏、肠道和肌肉等病变组织，经匀浆、离心等处理后B.4Dot-ELISA测定参照Berger等8方法进行。将孔径0.22μm的硝酸纤维素滤膜(NCM,Amersham公司产品)依次浸入去离子水和TBS(0.01mol/LTris·HCl,pH7.5,0.9%NaCl)溶液各5min,然后置于带抽滤设备的点样器上，抽滤点样。被检样品用PBS倍比稀释，每样品点25μL,37℃下干燥1h后用TBS配制的5%BSA封膜15min,然后转入终浓度(5-10)μg/mL的兔抗GCHVIgG中，37℃下孵育1h,用TBS配制的0.05%NP-40洗涤3次，每次5min,然后再加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG或辣根过氧化物酶标记的A蛋白(SPA-HRP,工作浓度1:1000),37℃下作用1h,如上洗小孔片，然后置微孔测定板内进行，检测中同时设正常鱼组织及空白PBS等作对照。B.5结果判定6附录C(规范性附录)冻干葡萄球菌A蛋白(简写SPA(+)菌)试剂，上海生物制品研究所生产。取感染GCRV的草鱼内脏、匀浆，以PBS10倍稀释，冻融3次，8000r/min离心30min,上清以16000r/min离心4h,经两次差异离心。沉淀悬浮于少量PBS中，即基本纯化的病毒抗原。-20℃保存。第一步：聚乙二醇(PEG6000)沉淀，病毒感染液8500r/min,4℃离心25min,收上清，缓缓加入40%PEG(含0.9%NaCl),使终浓度为7.5%,用1mol/LNaOH调pH值为7.5,4℃过夜，以8500r/min,4℃离心30min。收沉淀悬浮于适量PBS(pH9.0)中，于4℃过夜，然后10000r/min4℃离心10min,收上清，即为浓缩提取的病毒。缓冲液中透析48h(4℃),然后用PEG20000进一步浓缩到一定的体积。取上述透析浓缩的病毒样品2ml加入15%～30%蔗糖梯度溶液的顶部，25000r/min,4℃离心2h,收集病毒区带部分。兔抗GCRV血清的制备：选2kg左右的健康家兔。将0.2mL提取的抗原和等量的完全福氏佐剂乳化液注射如淋巴结内，即为基础免疫。14天后于两侧鼠蹊皮下个注射同上计量的抗原佐剂乳化液为第二次加强免疫。于21天在两侧臀部肌肉各注射同上佐剂量的抗原佐剂乳化液为第三次加强免疫。末次注射后9天颈静采血，得到免疫兔抗血清。用正常草鱼组织经同样提纯后的材料吸收，37℃保温1h,4000r/min离心30min,去沉淀即特异性抗血清，灭活后-20℃保存。7为1:10。兔GCHV抗血清也可以购买。病鱼组织样品的制备。取病鱼的肝、脾、肾、肠和肌肉等组织。各按1:10(w/v)加PBS液。匀浆后，3500rpm离心30min,取上清液备用。正常鱼组织按同法制备。染毒培养细胞样品制备。感染病毒的细胞经一定时间后收获，冻融3次，3500r/min离心30min,取上清液备用。正常细胞按同法制备。C.4.1葡萄球菌体试剂的致敏。将冻干葡萄球菌菌体试剂悬浮于1mL无菌水中，加入0.1mL兔抗血清，37℃水浴温育30min,用0.01M,pH7.2的PBS液离心洗涤3次，再悬浮于1mL同一缓冲液中，为标记试剂待用，使用时作1:16稀释。C.4.2测试。取待测样品液约20μL,标记试剂约20μL,在载玻片上用玻璃棒混匀，3min后肉眼观察凝集反应程度，并按下述标准作为结果判定(试验时设对照组):a.液体完全透明，试剂凝成粗大颗粒，即b.液体几乎完全透明，试剂凝成较大颗粒，即75%菌体被C.5结果判定8(规范性附录) :24:1),用力混合至少60s。12000rpm离心5min,取上层水相(约750μL)。加750μL氯仿/异戊醇(24:1),用力混合至少30s。12000rpm离心5min,取上层水相(约600μL)。加1.5倍2%CTAB配方(1.4MNaCl,20mMEDTA,100mMTris·HClpH=7.5,使用前加入总体积0.25%的模板(病毒悬液)D.3逆转录，加入以下体系40℃下反应60min,再95℃下10min灭活。D.4PCR反应体系dNTP(10mM)9 DDWTotal混匀后，在上面加50μL矿物油。短时间离心，让矿物油在上层。94℃4min→94℃30s→57℃30s→72℃1.0min,35个循环，72℃10min→4℃保温。反应引物如下：GV14S6R:5'-AGTTCTCAAAGCTGAGAGV14S6F:5'-ACGTGCGATTGGAAGAGCTT-3'(320bp)GV873-M5R:5'-TTATCAGGTGCCD.5琼脂糖核酸电泳D.5.5紫外灯下观察核酸带。注意胶不要太厚。不要忘记撕掉四周的胶带。要保持EB的浓度(决定带的亮度)、电泳液的浓度(决定带的形状)、琼脂平板的平整度(决定带是否整齐)。DNA分子量Marker用量为1μL(小孔)～1.5μL(大孔),检测样品用6μL(小孔)～10μL(大孔)。Taq酶和反转录酶最后加，并保存在-20℃。否则极易失活。2012参考文献[1]中国科学院水生生物研究所第三室病毒学组、武汉大学病毒研究所电镜室.草鱼出血病病原的研究一电镜观察.水生生物学集刊[J],1980,7(1):75-80.[2]郑德崇.草鱼出血病的电镜观察[J].水产学报，1991,15(4):317～321.[3]郑德崇等.草鱼出血病的组织病理研究[J].水产学报.1986,10(2):151-159.[4]邱并生.草鱼出血病.微生物学通报，2011,38(6):964[5]陈燕燊.草鱼出血病病毒形态结构及其理化特性的研究[J].科学通报，[6]毛树坚.草鱼出血病的病原研究[J].水产学报，1989,13(1):1-5.[7]李军.草鱼出血病病毒的研究进展[J].海洋与湖泊，1999,30(4):445-453.[8]杨广智.葡萄球菌A蛋白协同凝集试验快速检测草鱼出血病病毒的研究[J].水产学报，[9]邵健忠.应用Dot-ELISA技术检测草鱼出血病病毒的研究[J].水产学报，1996,20(1):[10]皮国华.快速ELISA的建立和应用[J].病毒学报，1995,11(4):381-382.[11]李军.应用逆