DB33T 2492-2022 虾肝肠胞虫核酸检测技术规范

33Technicalspecificationfornucleicaciddhepatopenaei浙江省市场监督管理局发布I本标准按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定本标准主要起草人：朱凝瑜、郑晓叶、梁倩蓉、叶键、1虾肝肠胞虫核酸检测技术规范4缩略语BstDNA聚合酶：嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶（BacCt值：反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacidNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribLAMP：环介导等温扩增（Loop-mediatedisothPCR：聚合酶链反应（polymerasechainreactiSYBRGreenIqPCRMix：含双链嵌合荧光染色剂的荧光定量2）：5.10This平衡酚（饱和酚）、1）：）：5.18琼脂糖：电泳级。5.27BstDNA聚合酶，8U/µL。36.5水平电泳槽：50mL～500mL，带有凝胶7.1.1.2对虾受精卵、幼体、仔虾及体长3cm以下稚虾虫、丰年虫等饵料生物样品取完整个体，冷藏运输进行核酸抽提。或置于灭菌采样容器内，加入待检将采集样品用研磨棒研磨均匀，取10mg～100mg组织匀浆液，置于灭菌1.5mL的离心管中，用于48.3冷却至室温，加入等体积平衡酚，颠倒混合10min，于10000r/min离心3min，取上层水相至新），9.1通用要求样品的PCR扩增应在PCR反应区独立完成，避免造成区域间污按商品化预混液说明书配制反应体系）。同时设阳性对照、阴性对照及空白对照。短59.2.3琼脂糖凝胶电泳加样孔朝负极，加入1×TAE电泳缓冲液至没过胶面匀后加入加样孔，同时设立DNA分子量标准对照。5V/cm电泳30min，当溴酚蓝2/3处时停止电泳，凝胶成像仪观察并判断结果。若条带未区分开，可适当增加电泳9.2.4结果判定9.2.4.3待测样品第一轮PCR在514bp处9.2.4.4结果判定可疑时，应用其他检测方法进行确认。9.3.1反应体系在荧光PCR管中加入2×SYBRGre阴性对照及空白对照。短暂离心后将PCR管置于9.3.2反应条件9.3.3结果判定9.4.1反应体系在荧光PCR管中加入10×ThermoPol缓冲液2.5μL、外最后加灭菌双蒸水至25μL体积（或者按商品化预混液说明书配制反应体系）。同时设阳性对照、阴性对照及空白对照。短暂离心后将PCR管置于恒温荧光PCR仪中或荧光定量PCR仪中选择SYBR通9.4.2反应条件9.4.3结果判定69.4.3.4结果判定可疑时，应用其他检测方法进行确认。7(资料性)EHP检测方法引物序列及其在靶基因中的位置A.1EHP套式PCR引物序列及其在靶基因中的位置A.1.1套式PCR引物序列套式PCR引物序列及浓度见表A.1。引物名称引物序列(5'→3')引物浓度GCTGTTTGTCTCCAACTGTA.1.2套式PCR引物在靶基因中的位置5'-ATGTTAGAAGATGCAAAGAGATATGTTGAAAGAAAAATTAAAAAAATTGAATACATTCATACAAAGTTACCAAAAAACAAAACAGGTACAGAAAAATGCGTGACGAACTAAATGTTTTGCAGAGTGTTGTTAAGGGTTTAAGTAATTACGAGTACAATTCTCAAACATTTTCACCATTGGTCAAATACAATTTCAAACACTGTAAACCTTAAAGCATTAAAAAGAGACGATATCACAGCATTTGTAGGATATGAGCTTTCAAATACAGTTGGAGACAAACAGCTTAAAGAAGTTTGCAATGATTTTTCTAAAGCATATGAATGCATATCAGAAGATAAAAGGAAAATGGATCATCAACGCAAAACTGTAAATAACCTAAGATATGATTTAGAAGAATTTAGAAAAAAAATTAGGAGAAACATCTGAAAAAACACTAGTAGAAATGGATGAATTTATGCATTTAAGTATGATAAAAGAAAATTGCAAAGACACATCGTGAATTTA.2EHP荧光定量PCR引物序列及其在靶基因中的位置A.2.1荧光定量PCR引物序列荧光定量PCR引物序列及浓度见表A.2。8表A.2EHP荧光定量PCR引物序列引物名称引物序列(5'→3')引物浓度ACAAAGTTACCAGAAGGTTATGA.2.2荧光定量PCR引物在靶基因中的位置荧光定量PCR引物在EHP靶基因中的位置见图A.2。AGAAAATTGCAAAGACACATCGTGAATTTT图A.2EHP荧光定量PCR引物在靶基因中的位置A.3EHPLAMP引物序列及其在靶基因中的位置表A.3EHPLAMP引物序列引物名称引物序列(5'→3')引物浓度TAGAAGATGCAAAGAGATATTACTTAAACCCTTAACAACACTCTAAGTTACCAGAAGGTTATGAATGGCGGCACAATTCTCAATGTCTGTGTAAATATCGTAACATTTAGTTCGTCACGCATTCAAACACTGTAAACCTTA.3.2LAMP引物在靶基因中的位置9F3