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DB33MethodofRT-PCRandthereal-timeRT-PCRforthedetectionofducktembusu浙江省市场监督管理局发布I本标准按照GB/T1.1-2009给本标准起草单位：浙江省动物疫病预防控制中1鸭坦布苏病毒RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测方法本标准规定了鸭坦布苏病毒的反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）和实时荧光定量RT-PCR的实验条鸭坦布苏病毒（DuckTembusuVir属于黄病毒科、黄病毒属、蚊媒病毒类、Ntaya病毒群，可引起鸭、鹅产蛋下降，雏鸭、雏鹅发病2）：液转移至棕色瓶中，室温避光保存，其工作糖完全熔化。待琼脂糖胶冷至50℃~60℃时，加EB溶液（终浓度0.5μg/mL）或5μL核酸染料，摇3.2.11商品化的一步法实时荧光RT-PCR5'-GCAACCAGGCAAAGAGGT5'-AAGTGAGCCTCATCCATAATDTMUV探针FAM-CCGTCATCCAACATC-4操作步骤与结果判定4.1样品采集与处理4.1.1组织器官5.1.1.2取待检组织样品适量（0.1g），按1:5倍（W34.1.2.1抗凝血4.1.2.2血清用无菌注射器直接吸取全血，自然凝固，3000r/min离心5mi4.1.3咽拭子、肛拭子用无菌棉签刮取家禽的咽部或泄殖腔粘膜，放入含0.1MPH7.4PBS的离心管内。3000r/min离4.1.4样品保存制备样品在冷藏条件不宜超过4h，长期保存应放入-4.2.1设立阳性、阴性样品对照，阳性对照为灭活的鸭坦布苏病毒感染a)样品处理好后，在样品处理区，取n+2个1.5mLDEPC处理44.3.1.2反应条件4.3.2.1反转录M-MLV反转录酶先加入去离子灭菌水，然后再按照顺序逐一加入表5中成分，每一次都应加入到液面以下。全部加4.3.2.3反应条件54.3.4结果判定5.3.4.2被检测样品扩增出567bp目的条带，判定为阳性；未扩增出5674.4.1反应体系设立阴性对照和阳性对照，按顺序加入表6中的成分。全部加完后，轻轻吹打混匀，500r/min离2×OneStepRT-PCRBTAKARAExTaq™HS(5U/µl)PrimeScript™RTEnzym///4.4.2反应条件4.4.3荧光素的设定ReportDye设定为FAM，QuencherDye设定为MGB或4.4.4结果判定64.4.4.2质控标准4.4.4.3结果描述及判

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