3-1-重组DNA技术的基本工具(第一课时)(人教版2019选择性必修3)

第3章基因工程•为什么传统的杂交育种方法培育不出抗虫棉，

基因工程却可以呢？•基因工程是如何进行操作的？•它给我们的生产和生活带来了怎样的影响？我国成为世界第二个拥有抗虫基因自主知识产权的国家！

指按照人们的愿望,通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作DNA重组技术。基因工程

操作环境：

操作对象：

操作水平：

工程实质：

工程产物：生物体外基因DNA分子水平人类需要的基因产物基因重组基因工程发展历程1944年艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物个体间转移。1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至19666年，64个密码子均被破译成功。1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性核酸内切酶（简称限制酶）1972年，伯格首先在体外进行了DNA的改造，成功构建了第一个体外重组DNA分子。1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。1973年，科学家证明了质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现了物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。1985年，穆里斯等人发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段。1.不同生物的基因为什么能拼接？2.外源基因为什么能在受体细胞中表达？(1)DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。(2)双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。(1)基因是控制生物性状的独立遗传单位。(2)遗传信息的传递都遵循中心法则。(3)生物界共用一套遗传密码。相同的遗传信息在不同的生物体内表达出相同的蛋白质。基因工程诞生的理论基础基因工程重组DNA技术的基本工具基因工程的基本操作程序基因工程的应用蛋白质工程的原理和应用第1节重组DNA技术的基本工具（第1课时）赵全华转基因番木瓜非转基因番木瓜

番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵害。当番木瓜受到这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。从社会中来

DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？DNA重组技术的基本工具：“分子手术刀”——限制性核酸内切酶“分子缝合针”——DNA连接酶“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体本节聚焦1、基因工程中需要哪些基本工具？2、这些基本工具的作用分别是什么？3、基因工程载体需要具备什么条件？（一）分子手术刀---限制性内切核酸酶（限制酶）

来源：主要从原核生物中分离纯化来的特点:作用部位:特定切点上的磷酸二酯键结果：形成黏性末端、平末端

种类：数千种能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列,并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。①原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原体的侵害。②限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中起到切割外源DNA、使之失效的作用，从而达到保护自身的目的。③因为限制酶识别DNA的特定核苷酸序列，所以不会伤害到自身的遗传物质。为什么原核生物中存在限制酶？这些酶的作用是什么？为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？

通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。1分子磷酸1分子脱氧核糖1分子含氮碱基DNA分子的基本组成单位1分子脱氧核苷酸=

+

+_______________

碱基AGCT磷酸脱氧核糖12534如何理解限制酶对双链DNA分子的特异性识别和切割？3',5'-磷酸二酯键每相邻两个脱氧核苷酸之间通过形成3ˊ,5ˊ-磷酸二酯键连接，多个脱氧核苷酸形成一条长链。

OHOH脱去H2O，形成磷酸二酯键仔细观察以下四种限制酶识别的特定序列有何特点？EcoRⅠ……G-A-A-T-T-C…………C-T-T-A-A-G……HindⅢ……A-A-G-C-T-T…………T-T-C-G-A-A……BamHⅠ……G-G-A-T-C-C…………C-C-T-A-G-G……SmaⅠ……C-C-C-G-G-G…………G-G-G-C-C-C……回文序列大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成两种常用的限制酶：EcoRⅠ和SmaⅠ试一试下面哪项不具有限制酶识别序列的特征（）

A．GAATTCB．GGGGCCCCCTTAAGCCCCGGGGC．CTGCAGD．CTAAATCGACGTCGATTTAGD基因的针线：DNA连接酶G

AA

TT

CC

TT

AA

GG

AA

TT

CC

TT

AA

GG

C

TT

AA

AA

TT

C

GG

C

TT

AA

AA

TT

C

GGC

TT

AA

AA

TT

C

G用EcoRI切割DNA片段1DNA片段2重组DNA片段这两种酶连接什么样的末端？一样吗？（二）分子缝合针---DNA连接酶作用：种类：①E.coliDNA连接酶②T4DNA连接酶将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。思考类型E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源________________________功能只缝合____________缝合____________和____________结果恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_________________大肠杆菌T4噬菌体黏性末端黏性末端平末端（效率低）磷酸二酯键判断对错（1）两个DNA片段的黏性末端必须互补才能通过DNA连接酶连接

起来。（2）T4DNA连接酶连接平末端的效率和连接黏性末端的效率相同。（3）DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事。因为黏性末端的碱基是互补的，在连接时，黏性末端可以通过碱基互补配对，加快DNA连接酶的连接速度，而平末端则不能。DNA连接酶DNA聚合酶相同点作用实质化学本质不同点模板作用对象作用结果 用途都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质

不需要需要DNA的一条链作模板形成完整的重组DNA分子形成DNA的一条链基因工程DNA复制只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键（三）分子运输车---运载体项目内容载体类型作用条件质粒、噬菌体、动植物病毒等将外源基因送入受体细胞的工具假如目的基因导入受体细胞后不能复制，转基因生物能产生预想的性状吗？霍乱弧菌的质粒有多个限制酶切点，你会用它做载体吗？如果载体没有切割位点将会怎样？如何确定目的基因是否进入受体细胞中了？对受体细胞无害有一个或多个限制酶切割位点，供外源基因插入能够在宿主细胞中复制并稳定地保存具有特殊的标记基因，供重组DNA的鉴定和选择质粒——基因工程中常用的基因载体

质粒是基因工程常用的载体，一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞核或原核细胞拟核之外，能自我复制的小型环状双链DNA分子，对宿主细胞没有影响，主要存在于细菌和酵母菌体内。其中最常用的是大肠杆菌质粒。真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的AATTCGGCATAC……TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGGCCGTATG…目的基因…

TCCTAG…

AGGATCTTAAAATTCCATAC…

GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGGGTATG…重组DNA分子的模拟操作AATTCGGCATAC……TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATG目的基因…

TCCTAG…

AGGATCTTAAAATTCCATAC…

GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGGGTATG…GCCGTATG…1、选目的基因两端和运载体都有的酶切位点；2、所选酶切位点不能破坏目的基因以及标记基因规律：---选择酶切位点的原则：HindIII和EcoRI下列操作中选用哪种限制酶切割来构建重组质粒？限