DB21-T 3794-2023 水质 底栖动物鉴定 DNA条形码法

ICS13.060.99DB21水质底栖动物鉴定DNA条形码法WaterQuality—IdentificationofMacrobenthos—DNABarcoding2023-08-30发布辽宁省市场监督管理局发布DB21/T3794—2023 2规范性引用文件 3术语和定义 4缩略语 5方法原理 6试剂和材料 7仪器和设备 8样品 9分析步骤 10结果计算 11质量保证与质量控制 12废物处理 13注意事项 附录A（资料性）序列搜索与比对 9附录B（资料性）进化树的构建与遗传距离的计算 11 DB21/T3794—2023本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由辽宁省生态环境厅提出并归口。本文件起草单位：辽宁省生态环境监测中心。本文件主要起草人：丁振军、李杨、姜永伟、王星蒙、问青春、王秋丽、张爽、胥学鹏、张峥、卢雁。本文件为首次发布。本文件发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈，我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。归口管理部门通讯地址：辽宁省生态环境厅（辽宁省沈阳市浑南区双园路30甲联系电话文件起草单位通讯地址：辽宁省生态环境监测中心（辽宁省沈阳市浑南区双园路30甲-3联系电话1DB21/T3794—2023水质底栖动物鉴定DNA条形码法警告：EB溶液具有遗传毒性，操作时应按规定要求佩戴防护器具，避免接触皮肤和衣物。本文件规定了利用DNA条形码技术鉴定底栖动物的方法。本文件适用于河流、湖泊和水库中底栖动物的鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T30989高通量基因测序技术规程HJ710.8生物多样性观测技术导则淡水底栖大型无脊椎动物T/CSES81淡水生物监测环境DNA宏条形码法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1底栖动物macrobenthos指生活史的全部或至少一个时期栖息于水体底部或底部基质中的不能通过0.5mm（40目）孔径网筛的无脊椎动物。[来源：HJ710.8-2014，3.2，有修改]3.2细胞色素c氧化酶亚基IcytochromecoxidasesubunitI，COI后生动物线粒体基因组上的线粒体细胞色素c氧化酶亚基I对应的DNA序列。[来源：T/CSES81-2023，3.7，有修改]3.3引物primer在DNA复制过程中，结合于模板链上并作为复制延伸的起始位点和/或终止位点的，具有一定长度和顺序的寡核苷酸链。[来源：GB/T30989-2014，3.11]3.4退火annealing模板双链DNA经热变性、双螺旋解开成单链后，通过缓慢冷却到特定温度，使引物与该模板DNA2DB21/T3794—2023单链重新配对，形成新的双链分子的过程称为退火。3.5聚合酶链式反应polymerasechainreaction，PCR模板DNA先经高温变性为单链，在DNA聚合酶和适宜的温度下，两条引物分别与模板DNA两条链上的一段互补序列发生退火，接着在DNA聚合酶的催化下以四种dNTP为底物，使退火引物得以延伸，如此反复变性、退火和DNA合成这一循环，使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增。[来源：GB/T30989-2014，3.14]3.6降落PCRtouchdownPCR，TDPCR一种退火温度逐渐降低的多循环PCR反应程序。由于前期退火温度高，引物结合难度增大，错配几率降低，目的片段的产率较低但准确率较高。后期随着退火温度的降低，前期积累的正确目的片段会被大幅扩增，使最终产物中目的片段的特异性大幅提高。3.7序列比对sequencealignment指运用特定的算法检测两个或多个序列之间的相似性，用于发现生物序列中的功能、结构和进化的信息。3.8遗传距离geneticdistance遗传距离指不同的种群或种之间的基因差异的程度，并以数值进行度量。3.9生物大分子序列比对搜索工具BasicLocalAlignmentSearchTool，BLAST一种基于局部比对算法的搜索工具，可将输入的核酸或蛋白质序列与数据库中的已知序列进行比对，获得序列相似度等信息，从而判断序列的来源或进化关系。3.10分子进化遗传分析工具MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis，MEGA一种用于分析物种亲缘关系、分子功能、遗传进化等的工具。可以实现序列比对和调参建树等功能。4缩略语下列缩略语适用于本文件。EB——溴化乙锭（Ethidiumbromide）DNA——脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）COI——细胞色素氧化酶亚基I（cytochromecoxidasesubunitI）PCR——聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）BLAST——生物大分子序列比对搜索工具（BasicLocalAlignmentSearchTool）MEGA——分子进化遗传分析工具（MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis）DB21/T3794—20235方法原理酚作为蛋白质变性剂使蛋白质变性，SDS将细胞裂解，蛋白酶K消化蛋白质成多肽，使DNA从蛋白质中游离出来。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂，离心后有机相在下层，DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间，从而分离得到总DNA。PCR反应可特异性的扩增正向引物和反向引物间的序列，经35次循环，目标COI序列可被扩增约235倍。与DNA结合的EB会被紫外光激发发出强烈的橙红色荧光，比未结合的EB荧光强度高几十倍，从而扩增的COI序列可被检测到。获得的COI序列经测序在NCBI或BOLD等公共数据库中搜索相似序列。将测序结果与搜索得到的序列一起绘制NJ进化树并计算遗传距离，一般遗传距离小于0.02cM的认为是同一种。DNA条形码法鉴定底栖动物流程图见图1。 图1DNA条形码鉴定底栖动物流程图6试剂和材料6.1无菌水：去离子水121℃灭菌。6.2无水乙醇（C2H6O）。6.370%乙醇。6.4乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA，C10H146.5三羟甲基氨基甲烷（Tris，C4H11NO3）。6.6十二烷基硫酸钠（SDS，C12H25SO4Na）。6.710%SDS溶液：称取SDS10g，加入约60mL去离子水，加热溶解，用浓盐酸调节pH至7.2，去离子水定容至100mL，常温备用。6.8三氯甲烷（CHCl3）。6.9Tris饱和酚溶液（pH7.7～8.1，市售）。6.10蛋白酶K溶液：400U/mL（市售）。6.11EB储存液：10mg/mL（市售）。6.12EB工作液：吸取10μLEB储存液加入200mL去离子水中，混匀，终浓度为0.5μg/mL。6.13琼脂糖（标准熔点）。4DB21/T3794—20236.141%琼脂糖凝胶：称取0.3g琼脂糖，加入30mL去离子水，微波炉加热至恰好全部熔化，立即倒入制胶槽中，插入制胶梳，临用现制。可根据制胶槽大小适当调整琼脂糖凝胶的制备量。6.151×TE缓冲液：6.1650×TAE缓冲液（市售）。6.171×TAE缓冲液：取20mL50×TAE缓冲液，去离子水定容至1L，常温备用。pH缓冲范围7.8～8.8。6.186×蔗糖凝胶上样缓冲液：含溴酚蓝、EDTA（市售）。6.192×TaqPCRMix预混液：含TaqDNA聚合酶、dNTP、MgCl2、PCR缓冲液和溴酚蓝（市售）。6.20DNA分子量标准（含上样缓冲液，市售100bp～2000bp，包含6条单一DNA条带，分别为：100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp。6.21PCR引物：LCO1490（GGTCAACAAATCATAAAGATATTGGHCO2198（TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA）。7仪器和设备7.1天平：准确到0.001g。7.2干式恒温器：56℃可调。7.3PCR仪：PCR反应程序可编辑。7.4水平电泳仪：电压100V可调。7.5离心机：12000r/min可调。7.6凝胶成像仪：具有紫外成像功能。8样品8.1样品采集底栖动物的采集按照HJ710.8相关规定执行。8.2样品保存底栖动物样品采集后，用无水乙醇冲洗干净，保存于无水乙醇中，冷冻条件下可长期保存。现场无冷冻条件的，应4℃冷藏保存并尽快送到实验室转为冷冻保存，冷藏条件保存不应超过3天，以防DNA发生分解。9分析步骤9.1总DNA的提取组织样本宜取自底栖动物肌肉部位，该部位线粒体丰富，易于获得较好的扩增效果。可选取底栖动5DB21/T3794—2023物个体腿部或胸部组织，如底栖动物个体较小（如摇蚊幼虫可将整个个体放入EP管中进行总DNA提取。取约25mg组织样本，用无水乙醇反复清洗数次，滤纸吸干，放入1.5mLEP管中，加入500μLTE缓冲液（6.15100μL10%SDS溶液（6.720μL蛋白酶K（6.1056℃恒温2h～4h至完全消化，消化前期应不时摇晃EP管，使管内溶液混匀。消化完成后，加入Tris饱和酚（6.9）600μL，混匀10min，12000r/min离心10min。取上清液加入1/2体积的三氯甲烷（6.8）、1/2体积的Tris饱和酚，混匀10min，12000r/min离心10min。取上清液加入相同体积的三氯甲烷，混匀10min，12000r/min离心10min。取上清液加入2倍体积的预冷至4℃的无水乙醇，-20℃沉淀1h～2h，12000r/min离心10min，小心倒掉上清液。使用预冷至4℃的70%乙醇400μL清洗杂质，轻微摇晃1min，12000r/min离心2min，弃去上清液。再次使用预冷的70%乙醇400μL清洗杂质，12000r/!存-20℃沉淀图2总DNA提取流程图也可使用市售试剂盒提取总DNA，具体操作步骤参照试剂盒使用说明书。建议优先选用市售试剂盒提取。9.2总DNA的电泳检测提取的总DNA应进行琼脂糖凝胶电泳检测，以判断总DNA提取情况。1%琼脂糖凝胶（6.14）制备完成后连同制胶槽一同放入电泳槽TAE缓冲液中，上样孔放置于电泳仪6DB21/T3794—2023负极方向，并使缓冲液液面略微超过凝胶上表面。吸取2.5μLDNA分子量标准（6.20）小心加入到第一个上样孔中；总DNA样品和6×蔗糖凝胶上样缓冲液（6.18）按5:1混合均匀，吸取2.5μL混合后的样品加入空上样孔中。计算电泳槽正负极间的距离，调节电泳仪，使电压不超过5V/cm～8V/cm。开始电泳，当溴酚蓝染料条带移动至凝胶约2/3位置时，电泳结束。9.3EB染色将结束电泳的琼脂糖凝胶从制胶槽中取出，放入EB染色液（6.12）中，使EB染色液没过凝胶，染色30min。取出后清水漂洗两次。注：也可使用其他染料替代EB，具体使用方法参见相关试剂说明书。9.4总DNA的凝胶成像将染色并漂洗后的凝胶放入凝胶成像仪中，紫外成像拍照，与DNA分子量标准对比，提取的总DNA大小一般大于2000bp。9.5PCR扩增此阶段共30次循环；再以45℃为退火温度循环5次。整个PCR过程共计35次循环。PCR反应体系和PCR反应程序见表1和表2。表1PCR反应体系加入量(μL）12324257DB21/T3794—2023表2PCR反应程序54——9.6扩增产物的电泳检测扩增产物按步骤9.2进行电泳检测。9.7EB染色扩增产物电泳结束后按步骤9.3进行EB染色。9.8PCR扩增产物的凝胶成像染色并漂洗后的凝胶按步骤9.4进行PCR扩增产物的凝胶成像分析。9.9测序扩增的COI序列可委托专业测序公司进行基因测序，测序结果文件为fasta格式。10结果计算10.1序列搜索与比对测试样品的测序结果在NCBI等国际公共数据库中BLAST搜索相似序列，一般要求相似性大于95%，将搜索得到的一条或多条相似序列与测序结果一起在MEGA等软件中进行序列比对（附录A）。10.2绘制NJ进化树并计算遗传距离比对完成后的结果使用Kimura2-parameter（K2P）模型，自展值（Bootstrap）不低于1000，绘制NJ进化树，计算遗传距离（附录B）。10.3结果判读若进化树上测试样品与搜索得到的序列聚为一支，且遗传距离小于0.02cM，即可判定测试样品与该序列为同一物种。11质量保证与质量控制11.1实验前的分类鉴定每次实验前应先对物种进行目或科的简单分类鉴定。11.2平行样的测定每次实验需开展平行双样测试，两次鉴定结果需完全相同，否则应查找原因并重新测试。8DB21/T3794—202312废物处理对于废弃的EB溶液可做如下处理：对于EB含量大于0.5mg/mL的溶液，将EB溶液用水稀释至浓度低于0.5mg/mL。加入一倍体积的0.5mol/LKMnO4，混匀，再加入等量的2.5mol/L盐酸，混匀，置室温数小时。加入一倍体积的2.5mol/LNaOH，混匀后按有毒有害废物处理。对于EB含量小于0.5mg/mL的溶液，按1mg/mL的量加入活性炭，不时轻摇混匀，室温放置1小时。用滤纸过滤并将活性碳与滤纸密封后按有毒有害废物处理。13注意事项EB具有毒性，实验室内应划分清洁区与EB污染区。实验时应带好手套等防护措施，若沾染EB后应使用大量清水清洗。9DB21/T3794—2023（资料性）序列搜索与比对A.1序列搜索序列搜索在NCBI网站（/）上进行，选择“Resources—DNA&RNA—BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）”，然后点击“NucleotideBLAST”按钮（图A.1进入到序列搜索界面。在搜索框中输入需要搜索的测序结果序列，点击“BLAST”搜索相似序列（图A.2以“.fasta”格式下载搜索结果列表（图A.3）中相似度最高的序列进行比对。图A.1NucleotideBLAST界面图A.2BLAST搜索序列界面DB21/T3794—2023图A.3BLAST搜索结果界面A.2序列比对将测序结果序列与搜索得到的序列放在同一个fasta文件中，在MEGA软件中打开该fasta文件，选择“AlignbyClustalW”进行序列比对，比对结果（图A.4）另存为“.meg”格式进行进化树的构建和遗传距离的计算。图A.4序列比对结果界面DB21/T3794—2023（资料性）进化树的构建与遗传距离的计算B.1进化树的构建将比对完成并保存的meg文件加载进MEGA软件，点击“Construct/TestNeighbor-JoiningTree”，选用“Bootstrapmethod”，自展值至少为1000次，模型选择“Kimura2-parametermodel”（图B.1点击“OK”开始构建进化树。构建的进化树如种类过多矩形树无法全部显示，可选用圆形树展示（图B.2观察测试样本与搜索到的样本的聚类情况。图B.1使用K2P模型构建NJ进化树的设置界面DB21/T3794—2023图B.2使用K2P模型构建的NJ进化树B.2遗传距离的计算点击“ComputePairwiseDistances”，同样选用“Bootstrapmethod”，自展值至少为1000次，模型选择“Kimura2-parametermodel”（图B.3点击“OK”开始计算遗传距离。图B.3基于K2P模型计算的遗传距离DB21/T3794—2023参考文献[1]HJ710.8-2014,生物多样性观测技术导则淡水底栖大型无脊椎动物[S].[2]ArnotDE,RoperC,BayoumiRAL.DigitalcodesfromhypervariabletandemLyrepeatedDNAsequencesinthePlasmodiumfalciparumcircu