金纳米棒的制备和应用

金纳米棒的制备和应用金纳米棒的制备及其在生命科学上的应用第一章研究背景金属纳米微粒的研究，尤其是对其形貌可控制备及其相关应用的性质和应用研究一直是材料科学以及相关领域的前沿热点。非球形的金纳米颗粒如棒、线、管及核壳结构相继被成功合成，其各种性质不仅仅依赖于尺寸而且还依赖于拓扑结构，其中金纳米棒（goldnanorods，GNRs）是最受关注的一类。金纳米棒是一种尺度从几纳米到上百纳米的棒状金纳米颗粒。金是一种贵金属材料，化学性质非常稳定，金纳米颗粒沿袭了其体相材料的这个性质，因此具有相对稳定，却非常丰富的化学物理性质。金纳米棒拥有随长宽比变化，从可见到近红外连续可调的表面等离子体共振波长，极高的表面电场强度增强效应（高至107倍），极大的光学吸收、散射截面，以及从50%到100%连续可调的光热转换效率。由于它独特的光学、光电、光热、光化学、以及分子生物学性质，金纳米棒在材料科学界正受到强烈的关注，并引发众多材料学家、生物化学家、医学家、物理学家、微电子工程师等科研工作者对之进行广泛和深入的研究。第二章GNRs的制备及修饰2.1GNRs的制备近年来，对于金纳米棒的合成已经研究出来许多有效的方法。主要分为晶种生长法，模板法，电化学法和光化学法等不同方法制备出分散性好颗粒均匀的金纳米棒。2.1.1晶种法晶种法研究的时间最长，因此研究的最深入。晶种可以是球型金纳米粒子，或者是短的金纳米棒。晶种法合成金纳米棒可以分为三个步骤：晶种的制备、生长液的配置、金纳米棒的生成。1种子制备：将5mL0.50mM氯金酸（HAuCl4)溶液与5mL0.2M十六烷基溴化铵（CTAB）混合，加入0.6mL冰冻的0.01M硼氢化钠（NaBH4）溶液，搅拌2min后25℃静置2h。2生长溶液制备：向反应容器中依次加入5mL0.20MCTAB，5mL1mMHAuCl4，0.5mL硝酸银（AgNO3），0.07mL0.10M抗坏血酸（AA），搅拌2min。3GNRs制备：在生长溶液中加入0.012mL种子溶液,搅拌2min后28℃，静置3h，得到充分生长的GNRs。在生长过程中纳米棒的纵横比可以通过改变晶种与金属盐的比例进行控制。在随后的研究中,通过调节溶液的pH也可改善纳米棒的合成。对于长的金纳米棒的制备，侧需使生长液中同时存在一定比例的CTAB与BDAC。另外通过控制CTAB浓度，也能进一步还原并获得高纵横比的金纳米棒。而DanielleK.Smith等报道应用不同厂家生产的CTAB都会对金纳米棒的制备产生影响。一定范围内Ag+的加入量能控制金纳米棒的纵横比，提高金纳米棒的产率。这种方法设备要求低，制备过程简单，改变反应物浓度就可改变纵横比，使用最广泛。2.1.2模板法模板法是指用孔径为纳米级到微米级的多孔材料作为模板，使前驱体进入后在模板的孔壁上反应，结合电化学沉淀法、溶胶凝胶法和气相沉淀法等技术，形成所需的纳米棒。模板法具有良好的可控制性：通过对模板尺寸的控制，可以制备出粒径分布范围窄、粒径可控、反应易于控制等贵金属纳米颗粒。Martin等最早利用模板法制备金纳米棒，利用金纳米棒的生长空间受限的原理，来合成金纳米棒。vanderZande等发展了该方法，利用电化学沉积法将金沉积在纳米多孔聚碳酸酯或氧化铝模板内，先喷上少量的导电基底，再电沉积金，随后去除模板，加入PVP以保护和分散金纳米棒，具体的制备流程如图1所示。邵桂妮等利用HAuCl4以柠檬酸三钠为还原剂，利用在多孔氧化铝(AAO)模板中浸泡金溶胶，制备出一维金纳米材料。总体来说，模板法的优点在于通过控制模板孔道的长度、直径以及电沉积时间可以有效的控制金纳米棒的长径比，但该方法最大的缺点在于生成金纳米棒的产率比较低，制备过程复杂，产物难以控制。图1(a)和(b)氧化铝膜的扫描电镜图；(c)模板法制备金纳米棒的流程图；(d)模板法制备金纳米棒的不同形貌TEM图2.2GNRs的表面修饰晶种法合成金纳米棒过程中使用大量的表面活性剂，十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），且CTAB分子在金纳米棒表面吸附，生物分子很难与金纳米棒偶联，从而限制了在生物分析中的应用，但是将大量的CTAB去除，又会导致金纳米棒由于缺少了颗粒之间相互排斥力而发生不可逆的聚集，这种聚集现象对许多应用是极为不利的；另外，金纳米棒溶液中有力的大量CTAB分子对蛋白分子有毒性，使用中需要适量去除在合成金纳米棒过程中大量的CTAB。2.2.1GNRs的m-SH-PEG表面修饰在去除GNRs溶液中CTAB的同时，为便于其体内应用，还需要对金纳米棒进行修饰以进一步提升金纳米棒的生物相容性。在研究中，我们首先利用具有良好生物相容性的m-SH-PEG对所合成的金纳米棒进行了初步的修饰，并测量和比较了两者的Zeta电位由于阳离子表面活性剂CTAB的存在，金纳米颗粒表面被阳离子包围，其Zeta电位显示为(28.47±1.15)mV相比之下，m-SH-PEG修饰后的金纳米颗粒的Zeta电位大大降低，说明每个金纳米棒上耦联的带正电荷的分子数目大大减少这一结果表明金纳米颗粒表面上绝大部分CTAB已经被m-SH-PEG所取代(表1)。表1m-SH-PEG修饰前后金纳米棒的Zeta电位值2.2.2GNRs@mSiO2的制备各向异性金纳米粒子的很多重要应用都需要将颗粒组装到表面，因此颗粒表面化学修饰是其中的关键。利用表面化学实验方法，不仅可以有效的保护金纳米棒避免聚集，而且使它们更适于组装。常做的处理是在金纳米颗粒表面包覆二氧化硅外壳。将制备所得的GNRs用Milli-Q去离子水清洗两遍，离心去除过量的CTAB后重新分散在40mL去离子水中。然后加入50uL氨水(25%，wt%)将GNRs水溶液调至pH10.0左右,再以3.5mLh-1速度滴加入10.5mL10mMTEOS/乙醇溶液。40℃条件下温和搅拌反应24h。反应产物分别用乙醇和水离心清洗数遍。为了更好去除介孔孔道内的CTAB残留分子，采用离子交换法，加入60mL乙醇/硝酸铵溶液(10mgmL-1)回流6h,然后再用乙醇溶液离心清洗。最后获得的GNRs@mSiO2产物分散于去离子水中保存。第三章在生命科学上的应用3.1医学成像随着科技发展、社会的进步，疾病诊断和治疗的非侵入式思想逐渐占主导。而在非侵入式的诊断和治疗领域中，活体生物组织的实时成像是人们一直追求的目标。但荧光成像技术面临着两个难题：（1）细胞在可见光区的自发荧光对标记分子所发信号的掩盖；（2）对所研究分子很难进行长期荧光标记观察。这就迫切需要研制开发光稳定性好的近红外荧光探针。采用双光子激发有以下优点：1）由于用近红外光激发，对活细胞的损伤很小，适于活体观察，光漂白作用也小；2）在组织中由于700～1000nm近红外光比可见光的透过率高，可达几个厘米，因此可观察样品中更深层的荧光像，能够进行体外或在体内的非破坏、非介入性分析；3）许多原本只能在可见区甚至是紫外区使用的荧光探测试剂也可以应用在近红外区域。金纳米棒的纵向共振峰通过调整长径比率可以精确调控到近红外区域，而这一近红外波长范围正是生物组织所具有的光的窗口，光穿透血管和其下面的组织，克服了可见光不能很好穿透组织的壁垒。金纳米棒是一种理想的“双光子荧光”成像类型，能比常规的荧光影像提供更高的对比度和亮度。这种高对比度的“非线性光学技术”具有灵敏检测早期癌细胞的能力。另外，与球形金颗粒相比，棒状金颗粒具有更为特殊的表面等离子体共振(SPR)特性，通过控制不同长短轴比可以实现纵向SPR峰位置的人为调控(从可见光区到近红外光区)。由于金纳米棒表面SPR的强吸收导致的发光特性，使其在生物组织成像，癌症的诊断和治疗中存在着巨大的应用前景。结合配体的金纳米棒能够特异性地标记癌症细胞上的受体，并提供特定分子的特有信息，进行生物成像和癌症检测。2005年美国Purdue大学的研究人员Wang等将金纳米棒颗粒注入实验鼠体内，在其流经血管时,利用双光子成像技术(TPL)透过皮肤得到了血管结构的原位图像。记录的图像比传统荧光染料法明亮得多，单个金纳米棒颗粒比单个罗丹明6G分子发出的双光子荧光要亮58倍。图2单个金纳米棒在实验鼠耳血管的原位成像：(a)两个血管的发射图像；(b)通过血管的金纳米棒颗粒的双光子图像；(c)发射图和单幅的双光子图像的叠加图；(d)与c图对应的双光子强度谱图3.2免疫检测生物活性物质如抗体蛋白等，由于自身可检测的信号比较弱，难以定量分析或检测。为此需引入外源标记物，通过其强的可检测信号来定量或示踪极微量的生物活性物质。已有的标记免疫分析包括酶免疫分析、化学发光免疫分析、电化学免疫分析和荧光免疫分析等。其中荧光分析以其无污染性及高灵敏度等特点而被广泛应用，是最为成熟和普及的标记技术。近年来，基于量子点荧光的生物标记技术也日益受到重视。但荧光谱峰较宽，信号的选择性相对较差；若用荧光分子标记，还存在光解和光致褪色现象，因而荧光标记技术亦有其局限性。近年来随着纳米科技的快速发展,SERS标记技术已引起了国内外科学家的广泛关注。首先，拉曼光谱具有高度的分子特征性，且谱峰窄，能减小不同分子间的谱峰重叠。其次，在多元检测中一种波长的激发光就能激发出不同的拉曼活性分子的谱峰。第三，SERS信号很少受光漂白的影响，可在一定程度上为获得较好的SERS信号而延长积分时间。第四，SERS信号不象荧光分子那样易发生自淬灭现象，可通过增加拉曼活性分子数目来提高信号强度，从而提高免疫检测的灵敏度。金纳米棒有着独特的光学性质，它有两个等离子体共振(SPR)吸收带：横向SPR吸收峰和纵向SPR吸收峰，其中纵向等离子体吸收峰的位置可以随其长径比的增大而逐渐红移。金纳米棒SPR的这种可调性使其能作为很好的SERS基底。因为按照SERS的电磁场增强机制，当激发光和SPR共振时，可以最大程度提高单个纳米颗粒的增强能力。基于金纳米棒表面增强拉曼散射(SERS)的免疫检测。将拉曼活性分子对巯基苯甲酸吸附于金纳米棒表面，制备出SERS标记的金纳米棒探针。该探针和蛋白抗体结合形成SERS标记抗体。通过SERS标记抗体、待测抗原和俘获抗体(固体基底上修饰的抗体，即俘获抗体)之间的免疫应答反应,将金纳米棒探针组装到固体基底上，形成SERS标记抗体-抗原-俘获抗体“三明治”夹心复合体。待测抗原浓度越大，固体基底上俘获的金纳米棒探针的数目越多，从而可通过SERS信号的强弱来检测待测抗原的浓度。由于金纳米棒的表面等离子体共振(SPR)峰位置可以在较宽的范围内调控，可通过激发光和SPR的耦合来提高SERS信号，从而提高免疫检测的灵敏度。单组分抗原可检出的浓度范围高于1×10－8mg/mL。图3SEM图（a）DSP-羊抗鼠IgG修饰的金基底（插图是没被修饰的金基底）（b）DSP-羊抗鼠IgG-鼠IgG修饰的金基底（c）鼠IgG浓度为1×10-4mgmL-1组装的三明治结构（插图是没有鼠IgG的情况）（d）鼠IgG浓度为1×10mgmL-1组装的三明治结构3.3癌症诊断和治疗金纳米棒总的消光包括散射和吸收两部分，对于直径小于10nm的金纳米棒，光的吸收远大于散射，而吸收的这部分能量最终将通过晶格的弛豫转化为热能。另一方面，对于生物体来说，近红外波段的辐射具有窗口效应，该频段的辐射能够以微弱的损失穿透生物体组织。因此可以利用金纳米棒在近红外波段较高的光吸收截面和优良的光热转换效率来制造光热疗法的试剂。通过在金纳米棒表面包覆一层与体液相容性良好的聚合物分子，金纳米棒可以在生物活体内进行长达15小时的流通与传输。科学家已经证明，金纳米棒以及相关的纳米结构可以通过光热疗法，在较小的光照剂量下杀死癌细胞。许多癌细胞的表面都覆盖着表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，EFGR)，EFGR为癌症提供治疗新靶点,而健康细胞则不会明显地显示出这种蛋白质。El-Sayed等将金纳米颗粒与抗-EFGR结合，用于选择性标记癌细胞，在暗场光学显微镜下可以实现癌细胞的成像。对于常用的球形金纳米颗粒对可见光的强吸收特性使得光能可以转换为热能，因此采用球形金纳米微粒辅助激光热作用方法，可以达到对癌细胞的选择性破坏。和正常细胞相比，杀死癌细胞只需一半的激光能量，而且不损害良性细胞。对于皮肤癌治疗或者诊断，球形金纳米颗粒是很好的选择。然而由于可见光不容易穿透生物组织，因此对于皮下组织的癌症的治疗或者诊断，球形金纳米颗粒就无能为力了。具有合适比率的金纳米棒颗粒则是很好的选择，因为它在近红外区(800—1200nm)对光的吸收和散射能力都很强。选择与金纳米棒颗粒LSPR波长相匹配的近红外激光作为光源，能够诱导皮下深层组织的金纳米棒颗粒产生热量，使之升温，因此金纳米棒颗粒对皮下深层组织的癌细胞能同时起到诊断(成像)和光热治疗的双重作用。El-Sayed等报道利用寡肽标记的金纳米棒进行细胞核标记，在暗场光学显微镜下，可以清楚地把癌细胞与正常细胞区分开(见图4)，并且使用800nm的激光照射可以选择性地杀死癌细胞(见图5)。图4纳米棒，分别与HaCaT细胞、HSC细胞和HOC细胞在室温下孵育30min后的光散射照片图5anti-EGFR/Au纳米棒与癌细胞孵育后，选择性光热治疗癌细胞第四章总结与展望Au纳米棒独特的光学性质使其在生物医学、生化标记、成像分析、信息存储等领域有了广阔的应用前景。纳米材料在生物体内相容性的问题研究才刚刚起步，如何将神奇的纳米材料和现代技术相结合，使得Au纳米棒在生物标记、免疫检测、荧光探针、生物成像、生物传感、疾病诊断和光热治疗以及信息存储等领域应用健康发展，还需要在这个学科方向中开展更深入广泛的研究。目前更多的是关注金纳米棒的制备调控及应用，而对金纳米棒在不同环境下的形成机理却无系统理论解释，进一步探索并发现金纳米棒的生长机制及规律将成为一个重要的研究方向。处于外界介电环境中的金属纳米颗粒的LSPR光谱特性由以下几个方面决定，纳米颗粒的半径α、纳米颗粒形状以及纳米颗粒所处环境的介电常数。而金纳米棒尚无完善的LSPR光学响应理论模型，进一步发展及完善贵金属纳米粒子的光学响应模型是下一步理论研究的重点。目前只有对纳米粒子的形貌、大小以及分布进行灵活的调控，才能制备出所需要的纳米传感器件，使其更好的应用于纳米传感、生物医学等领域。参考文献【1】柯善林,阚彩侠,莫博等.金纳米棒的光学性质研究进展[J].物理化学学报,2012，28(6):1275-1290.【2】缪煜清,刘仲明,官建国.纳米技术在生物传感器中的应用[J].传感器技术,2002,21(11).【3】曹艳丽,丁孝龙,李红臣等.形貌可控贵金属纳米颗粒的合成、光学性质及生长机制[J].物理化学学报,2011，27(6),1273-1286.【4】郭红燕,卢玲慧,吴超等.SERS标记的金纳米棒探针用于免疫检测[J].化学学报,2009,67(14).【5】范艳平.金纳米棒制备综述[J].化学工程与装备,2011.【6】杨淑华,王怡,周勇等.金纳米棒制备、修饰及与寡核苷酸适配子的偶联[J].军事医学科学院院刊,2010,34(6).【7】马占芳,田乐,邸静等.基于金纳米棒的生物检测、细胞成像和癌症的光热治疗[J].化学进展,2009，21(1).【8】王明星,何婧琳,曹忠.金纳米棒的合成及应用研究进展[J].广东化工,2011,38(8).【9】杨玉东,徐菁华,杨林梅等.金纳米棒的光热性质及其在生物医学成像和光热疗法中的应用[J].激光与光电子学进展,2010.【10】沈顺.介孔二氧化硅包覆金纳米棒的肿瘤热疗-化疗联合治疗研究[D].上海,复旦大学,2012.【11】王春刚.金纳米棒的表面修饰及其生物识别的研究[D].吉林长春,东北师范大学,2007.【12】余金妹.金纳米棒的二氧化硅表面修饰及生物相容性研究[D].安徽合肥,安徽医科大学,2012.【13】张天幕.金纳米棒-生物靶向分子耦合体制备及应用研究[D].吉林长春,长春理工大学,2012.【14】邹楠.金纳米棒复合材料的合成及其表面增强拉曼散射研究[D].吉林长春,长春理工大学,2010.【15】黄劭文.基于金纳米棒局域表面等离子体共振构建生物传感器的研究[D].湖南湘潭,湖南科技大学,2011.【16】A.Brioude,X.C.Jiang,M.P.Pileni.Opticalpropertiesofgoldnanorods:DDAsimulationssupportedbyexperiments[J].J.Phys.Chem.B,2005,109(27):13138～13142.【17】K.G.Thomas,S.Barazzouk,B.I.Ipeetal..UniaxialPlasmoncouplingthroughlongitudinalself-assemblyof