第二章-基因工程制药123节

第二章

基因工程制药第一节概述第二节基因药物生产的过程第三节目的基因的获得第四节基因表达第五节基因工程菌生长代谢的特点第六节基因工程菌的不稳定性第七节基因工程菌中试第八节重组工程菌的培养第九节高密度发酵第十节基因工程药物的分离纯化第十一节变性蛋白的复性第十二节基因工程药物的质量控制第一节概述生物技术的核心就是基因工程，基因工程技术最成功的应用就是用于生物治疗的新型生物药物的研制。1982年人胰岛素在美国的问世，带来了巨大的经济和社会效益。生物技术用于疾病的预防和疑难杂症的治疗已经成为了现实传统生物药物由于来源及制备上的困难、价格等因素的影响，此外在制备过程可能受到的病毒、衣原体、支原体等的感染等问题，促使人们寻求安全、实用、疗效可靠的新方法来制备生物药物基因工程正在逐渐显示其在生物技术药物制备上的优势应用基因工程技术可十分方便且有效地解决上述提到的问题，从量、质上都可以得到改进，且可以创造全新物质如今，癌症、病毒性疾病、心血管疾病以及内分泌等方面的预防、治疗和诊断已可通过基因工程技术获得基因工程新药的主要蛋白和多肽：①免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体②细胞因子，如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激因子、③激素，如胰岛素、生长素、心纳素④酶类，如尿激酶、超氧化物歧化酶心纳素一种由心房合成、贮存和分泌的活性多肽，又称心房利钠因子(ANF)或心房利钠肽(ANP)。具有强大的利钠、利尿、舒张血管、降低血压和对抗肾素－血管紧张素系统和抗利尿激素作用细胞因子细胞因子的术语首次提出是20世纪70年代中期，这一词曾用于指那些控制分化和调节免疫系统细胞的多肽生长因子，像干扰素（IFN)和白细胞介素（IL）就是主要的细胞因子多肽家族现代概念：细胞因子是一个调节蛋白或糖蛋白构成的多样性群组，这些分子通常是由机体微量产生，它们在不同的细胞间充当化学通信分子，通过与特异性细胞表面受体结合诱导细胞效应，从而激活各种细胞内信号转导事件构成调节分子中细胞因子组群的主要蛋白/蛋白家族白介素（IL-1～IL-15）红细胞生成素（EPO）干扰素（IFN-α，IFN-β，IFN-γ，IFN-ψ，

IFN-τ成纤维生长因子（FGF）集落刺激因子（G-GSF，M-GSF，GM-GSF）白血病控制因子（LIF）肿瘤坏死因子（TFN-α，TFN-β）巨噬细胞演性蛋白（MIP-1α，MIP-1βMIP-2）神经营养因子（NGF，BDNF，NT-3，NT-4/5）白小板源性生长因子（PDGF）睫状神经营养因子（CNTF）转化生长因子（TGF-α，TGF-β）神经胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）白小板生成素（TPO）表皮生长因子(EGF)主要基因工程药物名称简写作用干扰素IFN抗病毒、抗肿瘤、免疫调节细胞介素IL免疫调节、促进造血集落刺激因子CSF刺激造血红细胞生成素EPO促进红细胞生成、治疗贫血肿瘤坏死因子TNF杀死肿瘤细胞、免疫调节、参与炎症和全身性反应表皮生长因子EGF促进细胞分裂、创伤愈合、胃肠道溃疡防治神经生长因子NGF促进神经纤维再生骨形态发生蛋白BMP骨缺损修复、促进骨折愈合组织纤溶酶激活剂t-PA溶解血栓、治疗血栓疾病血凝因子Ⅷ、Ⅸ治疗血友病生长激素GH治疗侏儒症胰岛素治疗糖尿病超氧化物歧化酶SOD清除自由基、抗组织损伤、抗衰老主要基因工程药物简介人胰岛素

胰岛素，多肽激素的一种，具有多种生物学功能，在维持血糖恒定，增加糖原、脂肪、某些氨基酸和蛋白质的合成、调节与控制细胞内多种代谢途径等方面都有重要作用商品名：甘舒霖药品名的商品名即不同厂家生产的同一种药物制剂可以起不同的名称，具有专有性质，不可仿用。商品名经注册即为注册药品，常用®表示。它是市场竞争的结果，药品质量的标志和品牌效应的体现。如左旋氧氟沙星是通用名，而“利复星”、“来立信”等即是它的商品名人生长激素（hGH)人生长激素是人的垂体腺前叶嗜酸细胞分泌的一种非糖基化多肽激素，主要功能为刺激身体生长，最近还发现它对一些细胞的增殖和分化以及DNA的合成有直接效应注射用的人生长激素商品名：安苏萌干扰素（TNF)是一类在同种细胞中具有广谱抗病毒活性的蛋白质，其活性的发挥又受到细胞基因组的调节和控制，涉及到RNA和蛋白质的合成。

干扰素是一种类似于多肽激素的细胞功能调节物质，是一种细胞素根据抗原特异性和分子结构的不同，干扰素可分为αβγδ四型α型干扰素又根据其结构不同再分为α1b,α2a、α2b等亚型，其区分表现为个别氨基酸的差异，如人干扰素α2a的第23位氨基酸赖氨酸残基，α2b的第23位位精氨酸残基商品名：尤靖安白细胞介素（IL)白细胞介素是由白细胞或其他体细胞产生的，又在白细胞间起调节作用和介导作用的一类细胞因子，是重要的免疫调节剂到目前为止，IL系列已发现的有18种，最主要的是IL-2、IL-6、IL-11、IL-12、IL-15商品名：欣美格集落刺激因子（CSF)CSF是一种能参与造血调节过程的糖蛋白分子，故又称为造血刺激因子或造血生长因子现在已知的CSF主要有四种粒细胞集落刺激因子（G-CSF)

巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF)

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF)

多功能集落刺激因子（Multi-CSF)注射用GM—CSF商品名：吉姆欣红细胞生成素（EPO)主要由成年人的肾脏分泌产生，是一种调节和维持血液循环中红细胞生理水平的重要激素，也是合成红细胞的主要刺激因子

EPO主要·本品用于慢性肾性贫血，也用于多发性骨髓瘤相关的贫血和骨髓增生异常及骨癌引起的贫血。对结缔组织疾病所致的贫血亦有效。商品名：宁红欣肿瘤坏死因子（TNF)肿瘤坏死因子这一名称是在最初发现时，观察到它的抗肿瘤活性而命名的TNF除了抗肿瘤活性外，对多种正常细胞还具有广泛的免疫生物学活性，如：炎症活性，免疫调节作用，抗病毒、细菌、真菌等目前TNF主要有三种主要由：激活巨噬细胞产生的TNF-α

激活淋巴细胞产生的TNF-β

由NK细胞产生的细胞毒因子TNF-γ组织型纤溶酶原激活剂（t-PA)组织型纤溶酶原激活剂是一种丝氨酸蛋白酶，能激活纤溶酶原生成纤溶酶，纤溶酶水解血凝块中的纤维蛋白网、导致血栓溶解，主要用于治疗血栓性疾病利用基因工程技术生产药品的优点可用于医药目的的蛋白质或活性多肽都是由相应的基因合成的基因工程的最大好处就在于它有能力从极端复杂的机体细胞内取出所需的基因，将其在体外进行剪切拼接、重新组合，然后转入适当的细胞进行表达，从而生产出比原来多数百、数千倍的相应蛋白质利用基因工程技术生产药品的优点（1）可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子等），为临床使用提供有效的保障（2）可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围（3）利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质（4）内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除。如白细胞介素-2的第125位半胱氨酸是游离的，有可能引起-S-S-键的错配而导致活性下降，如将此半胱氨酸改为丝氨酸或丙氨酸，白细胞介素-2的活性以及热稳定性均有提高（5）利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源

基因工程技术可将不同种类和用途的基因，在原核细胞中表达的特性使其不仅在医药，而且在很多行业中都会有重要的应用。我国的基因工程药物我国基因工程药物主要集中在仿制上。必须开展创新基因工程药物的研究，如蛋白质工程产品、各种融合蛋白、各种细胞因子突变体和衍生物、小分子功能肽类等。可通过分子设计、有控制的基因修饰及基因合成，创造世界时原本没有的，但生物功能更优越的新型基因工程药物。我国的生物技术下游技术开发落后于上游技术，上游技术与国际水平仅相差3-5年，但下游技术则至少落后15年以上。我们必须改变这种状况，加强下游技术的研究和开发，使之与上游技术同步发展，尽量缩短与国际先进水平的差距。第二节基因工程药物生产的基本过程基因工程技术：将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建工程菌（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术基因工程基本过程基因工程药物制药的主要程序⒈目的基因的克隆⒉构建DAN重组体⒊DAN重组体转入宿主菌⒋构建工程菌⒌工程菌发酵⒍表达产物的分离纯化⒎产品的检验等以上程序中的每个阶段都包含若干细致的步骤，这些程序和步骤将会随研究和生产条件的不同而改变获得目的基因组建重组质粒培养工程菌构建基因工程菌或细胞产物分离纯化除菌过滤半成品检定包装成品检定基因工程药物制备的一般过程基因工程药物生产的上游和下游上游：主要指的是目的基因分离、工程菌（或细胞）构建。上游阶段的工作主要在实验室内完成下游：主要指的是从工程菌（或细胞）的大规模培养一直到产品的分离纯化、质量控制等下游阶段在产业化中是极其重要的下游阶段是将实验室成果产业化、商品化，主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等工程菌的发酵工艺不同于传统的抗生素和氨基酸发酵，需要对影响目的基因表达的因素进行分析，对各种影响因素进行优化，建立适于目的基因高效表达的发酵工艺，同时建立一系列相应的分离纯化、质量控制、产品保存等技术工程菌（或细胞）构建中重要的工具该过程中重要的工具便是酶：限制性内切酶和连接酶是将所需目的基因插入适当的载体质粒或噬菌体中并转入大肠杆菌或其他宿主菌（细胞）大量复制目的基因过程中的重要工具同时为保证目的基因的正确性，对目的基因要进行限制性内切酶和核苷酸序列分析基因表达系统就是上述的工程菌或细胞，有原核生物和真核生物两类表达系统；选择基因表达的系统主要考虑的是保证表达蛋白质的功能，其次要考虑的是表达量的多少和分离纯化的难易。第三节目的基因的获得问题：来源于真核细胞的产生基因工程药物的目的基因，为什么不能进行直接分离？CentralDogmaofMolecularBiology

中心法则One-waytransferofgeneticinformationfromnucleicacidtoproteiniscallCentralDogmaofMolecularBiologyInformationTransferin

ProkaryotesandEukaryotesProkaryotesEukaryotes第三节目的基因的获得对于目的基因的获得需要根据目的基因的来源采取适当的方法对于真核细胞来源的目的基因，是不能直接进行分离的。真核细胞中单拷贝基因仅是染色体DNA中很小一部分(10-5~10-7)，即使多拷贝基因也是极少的，因此从染色体中分离纯化目的基因是很困难的另外，原核表达系统是有局限性的，主要是由于真核基因的内含子及基因的后翻译过程

真核基因内一般都有内含子，如果以原核细胞作为表达系统，即便分离出真核基因，由于原核细胞缺乏mRNA的转录后加工过程，真核基因转录的mRNA也不能加工，拼接成成熟的mRNA,因此，不能直接克隆真核基因目前克隆真核基因常用的方法有反转录法和化学合成法

一、反转录法反转录法就是先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA的克隆表达为了克隆编码某种特异蛋白质多肽的DNA序列，可从产生该蛋白质的真核细胞中提取mRNA，以其为模板，在逆转录酶的作用下，反转录合成该蛋白质mRNA的互补DNA（cDNA第一链），再以cDNA第一链为模板，在逆转录酶或DNA聚合酶I（或者Klenow大片段）作用下，最终合成编码该多肽的双链DNA序列cDNA与模板mRNA序列严格互补，而不含内含子一反转录法1、mRNA的纯化2、cDNA第一链的合成3、cDNA第二链的合成4、cDNA克隆5、将重组体导入宿主细胞6、cDNA文库的鉴定7、目的cDNA克隆的分离和鉴定cDNA克隆示意图1mRNA的纯化分离纯化目的基因的mRNA是极其困难的，细胞内含有3种以上的RNA，mRNA占细胞内总RNA总量的2%~5%，相对分子质量大小很不一致，由几百到几千个核苷酸组成细胞内RNA的组成和含量:DNA:95%核内，5％细胞器RNA：75％细胞质，10%核内，15%细胞器rRNA80-85%;tRNA10-15%；mRNA2-5%1mRNA的纯化在真核细胞中mRNA的3‘末端常常含有一多聚腺苷酸polyA组成的末端，长达20~250个腺苷酸，可采用Oligo

dT-纤维素，以亲和层析法将mRNA从细胞总RNA中分离出来。洗脱方法是高浓度盐溶液使mRNA特异结合于寡聚dT，再以低盐溶液和蒸馏水将其洗脱，经过两次寡聚dT，可得到较纯的mRNATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

AAAAA

AAAAAOligo(dT)纤维素Poly(A)--Oligo(dT)100mMNaCl洗脱rRNA/tRNA10mMTris1mMEDTAPoly(A)mRNATotalRNA2cDNA第一链的合成cDNA

为具有与某RNA链呈互补的碱基序列的单链DNA即complementary

DNA之缩写一般mRNA都带有3‘-polyA，所以可用寡聚dT作为引物，在逆转录酶的催化下，开始cDNA链的合成。在合成反应体系中加入一种放射性标记的dNTP，在反应中以及反应后可通过测定放射性标记的dNTP掺入量，计算出cDNA的合成效率；在凝胶电泳后，进行放射自显影分析产物的分子大小，探索最佳反应条件。一次好的逆转录反应可使寡聚dT选出的mRNA有5%~30%被拷贝。3cDNA第二链的合成先用碱解或RNaseH酶解的方法除去cDNA-mRNA杂交链中的mRNA链，然后以cDNA第一链为模板合成第二链。由于第一链cDNA链3‘末端往往形成一个发夹形结构，所以，可以从这一点开始合成cDNA第二链。此反应是在DNA聚合酶I催化下完成的。核酸酶S1专一性切除单链DNA，因此用它可以切除发夹结构。发夹结构结构切除后，双链cDNA分子的大小常用变性琼脂糖凝胶电泳进行测定4cDNA克隆用于cDNA克隆的载体有两类：质粒DNA（如pUC、pBR322等）和噬菌体DNA（如

gt10、

gt11等）。根据重组后插入的cDNA是否能够表达、能否经转录和翻译合成蛋白质，又将载体分为表达型和非表达型载体pUC及gt11为表达型载体，在cDNA插入位置的上游具有启动基因顺序；而pBR322及gt10为非表达型载体。在cDNA克隆操作中应该根据不同的需要选择适当的载体cDNA插入片段小于10kb，可选质粒载体，如大于10kb则应选用噬菌体DNA为载体选用表达型载体可以增加目的基因的筛选方法，有利于目的基因的筛选

质粒（Plasmid）

是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子,大小约为数千碱基对。常有1~3个抗药性基因，以利于筛选。大肠杆菌T2噬菌体蝌蚪形噬菌体结构模式图表达质粒pUC第一，具有较小的分子量和更高的拷贝数;

仅保留了pBR322的氨苄青霉素抗性基因和复制起点；在操作过程中复制起点内部发生了自发突变造成了基因rop的缺失，它是控制质粒的特殊因子，从而使拷贝数增加，平均每个细胞500~700个拷贝。第二，适用于组织化学检测重组体；具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ’基因，所编码的α-肽链可参与α-互补作用，用Xgal显色对重组子进行鉴定，而pBR322质粒的重组子要进行两步的选择。

第三，具有多克隆位点MCS区段．方便具有不同粘性末端的外源片断的插入pUC质粒载体的优点非表达质粒pBR322

1、具有较小的分子量；它的分子量为4363bp。克隆载体的分子量大小不要超过10kb

2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。

pBR322DNA分子中总共有24种核酸内切酶只具有单一的酶切识别位点。其中7种内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，2种识别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶切位点插入外源片断可以导致tetr

基因的失活；另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因有单一的识别位点3、具有较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后每个细胞中可积累1000~3000个拷贝pBR322质粒载体的优点噬菌体载体

gt10和gt11cDNA文库R.Young和R.Davis设计的

gt10和gt11是噬菌体克隆载体，可用于构建cDNA文库。一方面它们具有较高的克隆效率，1ng

cDNA可产生5000个克隆，另一方面又可容纳较大分子量的外源DNA片段因为筛选噬菌斑在技术操作上较筛选细菌菌落更方便，因此gt10和gt11类载体在构建文库时优于质粒载体pBR322

gt10载体在合适的宿主中，

gt10载体对于未携带cDNA的噬菌体的裂解生长有很强的生物学选择作用。cDNA插入到gt10中可使噬菌体阻碍物基因（cI）失活。当用大肠杆菌c600的突变型hflA（高频溶原性）作为宿主时，只有携带cDNA插入片段的噬菌体可形成噬菌斑，而在非突变型大肠杆菌c600宿主菌中，带与不带cDNA插入片段的噬菌体都可形成噬菌斑。

gt11载体

gt11则没有类似gt10载体的选择作用，但它是蛋白质表达的cDNA克隆载体

gt11的宿主菌是大肠杆菌Y1090。

gt11中cDNA插入片段是克隆在-半乳糖苷酶基因编码区（lacZ）的羧基端，在含IPTG（isopropylthio--D-galactoside,异丙基硫代--D-半乳糖苷）和X-gal（5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-galactoside,5-溴-4氯-3-吲哚--D

-半乳糖苷）的平板上，带cDNA插入片段的gt11可形成清晰的无色噬菌斑，未带cDNA插入片段的gt11则形成蓝色噬菌斑。cDNA插入片段的翻转产物可表达成半乳糖苷酶-cDNA融合蛋白cDNA片段与载体的连接方法一：加同聚尾连接，用3‘末端脱氧核苷酸转移酶催化，使载体与cDNA的3’末端带上互补的同型多聚体序列，如载体加上polyC（或A）的尾巴，则cDNA加上polyG（或T）的尾巴，这两种粘性末端只能使载体与cDNA连接而不能自我环化，借助同型多聚体的退火作用形成重组分子，最后用T4DNA连接酶封口同聚物接尾法实际上是一种人工粘性末端连接法,具有很多优点:①首先不易自身环化,这是因为同一种DNA的两端的尾巴是相同的,所以不存在自身环化②因为载体和外源片段的末端是互补的粘性末端,所以连接效率较高③用任何一种方法制备的DNA都可以用这种方法进行连接,所以是一种通用的体外重组的方法。cDNA片段与载体的连接方法二：加人工接头连接，用T4DNA连接酶在平末端接上人工接头可以使DNA发生连接。所谓人工接头是指人工合成的、连接在目的基因两端的含有某些限制酶切位点的寡核苷酸片段。cDNA连上人工接头后，用该种限制酶酶切就可得到粘性末端，从而能够与载体连接；cDNA中也可能也带有同样的限制酶切点，为了保护cDNA不受限制酶破坏，可在加接头前用甲基化酶修饰这些限制酶切位点CCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-5将重组体导入宿主细胞体外包装的噬菌体，感染感受态大肠杆菌形成噬菌斑；或转化感受态大肠杆菌使质粒进入细胞内将重组DNA或其他外源DNA导入宿主细胞，常用的方法有转化（transformation）感染（infection）和转染（transfection）（一）转化（transformation）转化是指将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。转化常用的宿主细胞是大肠杆菌。大肠杆菌悬浮在CaCl2溶液中，并置于低温（0～5℃）环境下一段时间，钙离子使细胞膜的结构发生变化，通透性增加，从而具有摄取外源DNA的能力，这种细胞称为感受态细胞（competentcell）。例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取

（二）感染（infection）

λ噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内繁殖。由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程也称为转导（transduction）。例：λ噬菌体的生活史

（三）转染（transfection）

转染是指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程常用的方法有电穿孔法（electroporation）、CaPO4沉淀法、脂质体融合法等。进入细胞的DNA可以被整合至宿主细胞的基因组中，也可以在染色体外存在和表达。上图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒进入细胞的一般过程。外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞6cDNA文库的鉴定根据重组体的表型进行筛选，主要有抗性基因失活法和菌落或噬菌斑颜色改变法。然后采用凝胶电泳、分子杂交、DNA序列分析测定等方法进行进一步筛选和鉴定。7目的cDNA克隆的分离和鉴定从cD