驴驹大肠杆菌病防治技术规程

驴驹大肠杆菌病防治技术规程范围本文件规定了驴驹大肠杆菌病的流行病学、临床症状、病理变化、诊断、预防、治疗、病死驴及病害驴处理和档案管理。本文件适用于养驴场驴驹大肠杆菌病的防治。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求GB39707医疗废物处理处置污染控制标准NY/T388畜禽场环境质量标准NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范NY5027无公害食品畜禽饮用水水质NY/T5030无公害农产品兽药使用准则术语和定义下列术语和定义适用于本文件。驴驹大肠杆菌病donkeyfoalscolibacillosis由O78、O101、O8等主要血清型的致病性大肠杆菌引起驴驹的急性、接触性传染病。病例特征呈现剧烈的下痢和败血症症状。流行病学病原特点病原为肠杆菌科大肠埃希氏菌属中O78、O101、O8等主要血清型的致病性大肠杆菌。病原菌为革兰氏阴性菌，在驴驹肠道及其粪便污染的环境中广泛存在。传染源发病驴驹和携带致病性大肠杆菌的驴。传播途径该病通过消化道传播，粪-口传播是主要途径。病原菌污染粪便、圈舍、饲料、水槽及饮水等均可传播。可通过脐带或分娩时经产道传播。易感动物8月龄内的驴驹均可发病，多于出生后2 d～3 d发病。发病特点一年四季均可发生，以冬末初春季节交替时段多发，潜伏期为1 d～2 d。发病率为5%～40%，病死率为2%～20%。临床症状驴驹发病初期体温升高，精神沉郁，食欲不振，粪便粥样或水样，剧烈腹泻，肛门失禁，排出液状粪便，呈黄色、白色或灰白色，有时含多量黏液或血液，腥臭味。发病中期出现衰弱，脱水，喜躺卧，无法站立。发病末期，食欲废绝，腹泻和便秘交替发生，由败血症和全身微循环衰竭致死。病理变化胃黏膜脱落，有出血点和出血斑。小肠、盲肠和结肠表现为黏膜脱落。肝脏肿大、淤血。脾肿大，包膜下有出血点。心内膜和外膜也有出血点，肠系膜淋巴结肿大、出血。诊断临床诊断驴驹出现腹泻或败血症等症状可假定大肠杆菌感染，根据流行病学、临床症状和病理变化等做出初步临床诊断。实验室诊断见附录A。采样按NY/T541的规定执行，主要采集肛拭子、腹泻物等病料。细菌分离培养无菌取病料，经三区划线接种于麦康凯培养基上，37 ℃恒温培养24 h，培养出表面光滑、粉红色圆形菌落。挑取符合大肠杆菌特征的单菌落纯化3次～4次。显微镜检将单菌落革兰氏染色，镜检，油镜下呈现两端钝圆，单在或成对的革兰氏阴性菌。生化鉴定将纯化后的细菌接种于葡萄糖、甘露醇、乳糖、麦芽糖、吲哚试验、V-P试验、甲基红试验、枸橼酸盐试验管，37 ℃恒温培养24 h后观察。结果显示：葡萄糖产酸产气、甘露醇产酸产气、乳糖产酸产气、麦芽糖产酸产气、吲哚试验和甲基红试验呈阳性，V-P试验和枸橼酸盐试验呈阴性。大肠杆菌O血清型鉴定将纯化的大肠杆菌接种于LB固体培养基上，37 ℃培养24 h，用0.5%石炭酸生理盐水洗下菌苔，制成浓稠悬液，经121 ℃高压2 h，制备O抗原。取洁净玻片，吸取O抗原滴于玻片两端，一滴加入10 μL抗O血清，一滴加入等量生理盐水。轻轻晃动玻片，倾斜玻片30°于1 min内观察试验现象。按照表A.1进行判定，出现“++”及以上凝集反应判定阳性结果。分离菌株16SrDNA序列测定提取分离菌基因组DNA为模板扩增16SrDNA序列。引物序列按照附录A。PCR反应体系为模板（基因组DNA20 ng/μL～50 ng/μL）2 μL，2×TaqPCRMasterMix12.5 μL，上下游引物（20 μmol/L）各1

μL，ddH2O8.5 μL，共25 μL反应体系。PCR反应程序为95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，53 ℃退火15s，72

℃延伸2min，共30个循环；最终72 ℃延伸5 min，4 ℃暂时保存。通过1%X脂糖凝胶电泳鉴定。片段大小约为1 500 bp。回收并纯化PCR产物，按照双脱氧链终止法测序。结果判定将PCR测序结果使用NCBI中的BLAST进行检索，是否与数据库序列一致。应根据临床诊断和实验室诊断结果确诊该病。实验室生物安全按照GB19489规定执行。预防环境卫生按NY/T388和NY5027的规定执行。夏季食槽和水槽应及时清理。生物安全生产区内不得饲养其他动物，不应屠宰和解剖病死驴，不带入其他畜产品。料库应有防鼠防鸟设施。管理妊娠母驴做好孕驴产前和产后护理工作，将临产母驴提前转入消毒好的专用产舍。接产人员应消毒。产后及时清理胎衣和其它排泄物并彻底消毒。寒冷季节做好产房保温。驴驹产后及时做好驴驹脐部消毒工作。驴驹吸吮初乳前，对乳区进行消毒，确保新生驴驹吃到足够初乳。驴驹断奶前应提前做好补料，预防断奶应激。驴驹设置独立圈舍，并保持圈舍干燥、清洁。秋冬季新生驴驹应做好保暖工作。预防措施根据流行病学调查结果，发病率高驴场，在分娩前3 d～5 d给予母驴微生态制剂或中兽药。治疗原则口服、注射方式投入兽药应符合NY/T5030的要求。抗菌药物的使用应根据实验室药敏试验结果，科学规范使用。方法采用对因治疗和对症治疗。推荐药物见附录B。病死驴及病害驴处理病死驴及病害驴的处理见《病死及病害动物无害化处理技术规范》（农医发[2017]25号）的规定。废弃物与病料处理按照GB39707规定执行。档案管理记录记录应统一、规范。记录内容包括驴的年龄，发病时间及症状、药品使用、药品的生产厂家、生产日期、剂量、疗程、消毒、免疫、实验室检测结果、疗效及停药时间。存档各种记录保存期限不低于两年，分类归档。

（规范性）

主要实验室诊断方法原理麦康凯选择培养基：大肠杆菌发酵乳糖产酸，PH值降低，麦康凯平板中的显色剂（中性红）显红色，同时有胆盐沉淀呈现粉色。革兰氏染色：G+菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高，乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。大肠杆菌O血清型鉴定：通过抗原与抗体的相互作用，使得抗原或抗体在一定条件下发生凝集现象，抗体是机体对抗原的特异性免疫应答产生的一种蛋白质，它可以与抗原结合形成免疫复合物。当抗原与抗体结合时，它们之间的亲和力会导致免疫复合物的形成，从而引起凝集反应。PCR反应：聚合酶链反应（PCR）是80年代中期发展起来的分子生物学技术。其基本原理是用两段人工合成的寡核苷酸片段为引物，以双链或单链DNA为模板，在DNA聚合酶作用下，经过反复多个循环的变性、复性、延伸等对特定的核酸片段进行扩增，这一方法稳定，能在很短的时间内扩增，得到大量所需要的特异性DNA片段，而且扩增的片段以2n的方式倍增。X脂糖凝胶电泳实验：凝胶电泳的原理是基于DNA分子的电荷和大小差异。DNA分子是带有负电荷的，因此可以在电场中移动。凝胶是一种具有微孔结构的材料，可以限制DNA分子的运动，使其只能通过微孔的大小进行分离。试剂或材料无菌棉签。生理盐水。麦康凯固体培养基。无菌培养皿。革兰氏染色试剂盒。载玻片。无菌试管。营养肉汤液体培养基。LB液体培养基。细菌基因组提取试剂盒。X脂糖。TAE缓冲液。DNA纯化试剂盒。PCRMix酶。ddH2O。无菌移液器枪头（10 μL、200 μL、1 000 μL）。2 mL无菌EP管。PCR反应管。仪器设备高速冷冻离心机：最大速度：14 800转每分，最大RCF：21 100 x g，温度范围：-9 ℃～+40 ℃。细菌培养箱：温度范围+28 ℃～+70 ℃。医用冰箱：冷藏室温度范围：2 ℃～8 ℃，冷冻室温度范围：-20 ℃～-40 ℃。超低温冰箱：温度范围-40 ℃～-86 ℃。PCR扩增仪。核酸电泳仪。恒温摇床：温控范围：RT+5 ℃～60 ℃，恒温状态温控精度：±0.1 ℃，温度均匀度：±0.5 ℃。正置显微镜。试验步骤无菌取病料，经三区划线接种于麦康凯培养基上，37 ℃温箱培养24 h，培养出表面光滑、粉红色圆形菌落。挑取符合大肠杆菌特征的单菌落纯化3次～4次。将单菌落革兰氏染色，镜检，油镜下呈现两端钝圆，单在或成对的革兰氏阴性菌。将纯化后的细菌接种于葡萄糖、甘露醇、乳糖、麦芽糖、吲哚试验、V-P试验、甲基红试验、枸橼酸盐试验管37 ℃恒温培养24 h后观察。将纯化的大肠杆菌接种于LB固体培养基上，37 ℃培养24 h，用0.5%石炭酸生理盐水洗下菌苔，制成浓稠悬液，经121 ℃高压2 h，制备O抗原。取洁净玻片，吸取O抗原滴于玻片两端，一滴加入10 μL抗O血清，一滴加入等量生理盐水。轻轻晃动玻片，倾斜玻片30°于1 min内观察试验现象，根据试验现象和表A.1，判断试验结果。将纯化的大肠杆菌接种于LB液体培养基中，置37 ℃恒温摇床中培养20 h，提取分离菌基因组DNA为模板扩增16SrDNA序列。PCR反应体系为模板（基因组DNA20 ng/μL～50 ng/μL）2 μL，2×TaqPCRMasterMix12.5 μL，上下游引物27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）；1492R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）各1 μL，ddH2O8.5 μL，共25 μL反应体系，按顺序加入PCR反应管内并混匀。PCR反应程序为95℃预变性5 min；95 ℃变性15s，53 ℃退火15s，72 ℃延伸2min，共30个循环；最终72 ℃延伸5min，4 ℃暂时保存。通过1%X脂糖凝胶经核酸电泳仪电泳鉴定。根据目的片段回收并纯化PCR产物，送生物公司测序。数据处理将PCR测序结果使用NCBI中的BLAST进行检索。O血清型鉴定判定标准反应强度判断依据对应结果++++液体完全透明，出现大的凝集块阳性+++液体几乎完全透明，有明显凝集块阳性++液体不甚透明，有可见凝集块阳性+液体浑浊，有小的颗粒状物阴性—液体浑浊，无凝集现象阴性

（资料性）

推荐治疗方法对因治疗根据药敏试验结果选择合适药物。消化道给药：口服或灌肠庆大霉素，磺胺脒等敏感药物。静脉注射或肌肉注射：庆大霉素、头孢类药物、氨基糖苷类药物。根据脱水程度，补充葡萄糖、钠制剂、钾制剂和维生素，调整胃肠机能。冬季补液应加温。对症治疗对症治疗：对症治疗是治疗本病的关键，患病驴常因心力衰竭、酸中毒、内毒素中毒等引起死亡，