海洋生物体中金刚烷胺的测定　液相色谱-串联质谱法

海洋生物体中金刚烷胺的测定液相色谱-串联质谱法警告：实验中使用的标准溶液、有机溶剂等均具有一定的毒性和挥发性，实验人员应避免与其直接接触，样品前处理过程应在通风橱中进行。范围本文件描述了海洋生物体中金刚烷胺液的液相色谱-串联质谱测定方法，包括原理、试剂及配制、仪器和设备、样品、分析步骤、结果计算与表示、准确度、质量控制和质量保证、废物处置等。本文件适用于海洋生物体鱼、虾、海参、海带和贝类中金刚烷胺的测定。当称样量为3.00 g时，金刚烷胺检出限为0.5 μg/kg，测定下限为1.0 μg/kg。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。原理海洋生物体样品用1%乙酸乙腈提取后，经固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量。试剂及配制实验室用水：GB/T6682，一级。甲醇（CH3OH）：色谱纯。甲酸（HCOOH）：色谱纯。乙腈（CH3CN）：色谱纯。氨水（NH4OH）：优级纯。乙酸（CH3COOH）：优级纯。1%乙酸乙腈溶液（体积分数）。取1 mL乙酸，用乙腈定容至100 mL。5%氨水甲醇溶液（体积分数）。取5 mL氨水，用甲醇定容至100 mL。0.1%甲酸溶液（体积分数）。取0.10 mL甲酸，用水定容至100 mL。0.1%甲酸乙腈定容液（体积分数）。将1 mL甲酸与300 mL乙腈，加入到700 mL水中。金刚烷胺标准品：CAS号768-94-5，纯度大于99.0%。D15-金刚烷胺内标溶液：CAS号33830-10-3，1 mg/mL。金刚烷胺标准贮备液。称取金刚烷胺0.010 0 g，用乙腈溶解，并定容至10 mL，配制成1.0 mg/mL标准贮备液，-20 ℃下避光保存，有效期为90 d。金刚烷胺标准工作液。移取100μL金刚烷胺标准贮备液（5.13），用乙腈溶解，并定容至100 mL，配制成1.0 μg/mL标准工作液，4 ℃下避光保存，有效期为30 d。D15-金刚烷胺内标标准中间液。移取100 μLD15-金刚烷胺内标溶液（5.12），用乙腈溶解，并定容至100 mL，配制成1.0 μg/mL内标标准中间液，4 ℃下避光保存，有效期为30 d。D15-金刚烷胺内标标准工作液。移取1 mLD15-金刚烷胺内标标准中间液（5.15），用乙腈定容至10 mL，配制成100 μg/L内标标准工作液，4 ℃下避光保存，有效期为7 d。仪器和设备液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾电离源（ESI源）。天平：感量分别为0.01 g和0.000 1 g。均质机。高速离心机：10 000 r/min。超声波清洗器。涡旋混合器。固相萃取装置。固相萃取柱：MCX（混合型阳离子固相萃取柱），60 mg/3 mL，或相当者。氮吹仪。聚丙烯离心管：50 mL。滤膜：聚偏氟乙烯滤膜，孔径为0.22 μm。样品制备鱼，去鳞、去皮，沿脊背取肌肉，将鳞、皮单独收集；虾，去头、去壳、去肠腺，取肌肉部分；海参、海带、贝等取可食部分，样品充分搅碎、混匀。如不能及时检测，-18 ℃以下冷冻保存备用。取适量新鲜或解冻的空白或供试组织，绞碎，并使均质。提取称取3.00（±0.01）g样品至50 mL离心管中，加入100 μL内标标准工作液（5.16）和15 mL1%乙酸乙腈溶液（5.7），涡旋30 s，超声提取15 min，8 000 r/min离心10 min，待净化。净化MCX固相萃取柱经6 mL甲醇（5.2）和6 mL水（5.1）活化后，取5 mL上清液移入固相萃取柱，3 mL水（5.1）淋洗，6 mL5%氨水甲醇溶液（5.8）洗脱，全程控制流速为2 mL/min～3 mL/min。收集洗脱液，用氮吹仪于40 ℃下吹至近干，用定容液（5.10）定容至1 mL，过滤膜，供液相色谱-串联质谱仪分析。空白试样的制备除不加试料外，均按上述测定步骤进行。分析步骤液相色谱质谱条件液相色谱条件：色谱柱：C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），或相当者；色谱柱温度：40 ℃；流速：0.25 mL/min；进样量：10 μL；流动相：A为乙腈（5.4）；B为0.1%甲酸溶液（5.9）；流动相梯度洗脱程序见表1。流动相梯度洗脱程序表时间min流速mL/min流动相A%流动相B%0.000.255950.500.255950.600.259555.000.259555.100.255957.000.25595质谱条件：离子化模式：ESI+；电离电压：2.50 kV；锥孔电压：25 V；离子源温度：140 ℃；锥孔反吹气流速：50 L/h；脱溶剂气温度：400 ℃；脱溶剂气流速：700 L/h；氩气流速：0.12 mL/min；测定方式：选择反应监测模式（SRM），定量离子和定性离子参数见表2。待测物定量离子和定性离子参数化合物母离子m/z子离子m/z锥孔电压V碰撞能量eV金刚烷胺152932530135a2517金刚烷胺内标167141a2517表示定量离子标准曲线的建立移取金刚烷胺标准工作液（5.14）10μL、20μL、40μL、50μL、100μL于进样瓶中，分别加入100

μL内标标准工作液（5.16），用定容液（5.10）定容至1mL，使金刚烷胺浓度分别为10.0 µg/L、20.0µg/L、40.0µg/L、50.0 µg/L、100 µg/L，现用现配。以各标准工作液金刚烷胺峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，以各标准工作液浓度为横坐标，绘制标准曲线。试样测定按照仪器条件（8.1），分别测定金刚烷胺标准工作液（8.2）、试样（7.3）、空白试样（7.4），金刚烷胺标准溶液、空白样品和加标样品的色谱图参见附录A。结果计算与表示定性分析在同样测试条件下，阳性样品的保留时间与标准工作液中待测物的保留时间偏差在±2.5%以内，在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的特征离子均应出现，且检测到的离子的相对丰度，应与浓度相当的校正标准溶液相对丰度一致。定性确证时相对离子丰度的允许偏差应符合表3的要求。定性确证时相对离子丰度的允许偏差相对离子丰度%允许偏差%＞50±20＞20～50±25＞10～20±30≤10±50定量分析按8.1设定仪器条件，待仪器稳定后，根据表2中的定量离子分别对金刚烷胺和内标进行测定，记录保留时间和峰面积，以峰面积比按内标法进行单点或多点校准定量，标准工作液和试样溶液中待测物的响应值均应在仪器检测线性范围内。结果计算样品中金刚烷胺的含量按公式（1）计算： （AUTONUM）式中：x

——样品中金刚烷胺的含量，单位为微克每千克（µg/kg）；c

——试样溶液中金刚烷胺的浓度，单位为微克每升（µg/L）；c0——空白试样溶液中金刚烷胺的浓度，单位为微克每升（µg/L）；V

——试样溶液的定容体积，单位为毫升（mL）；m——样品的湿重，单位为克（g）。结果表示计算结果扣除空白值，测XX果用两次平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。准确度精密度本方法批内相对标准偏差和批间相对标准偏差均小于15%。详见表B.1。正确度金刚烷胺在添加浓度1.0 μg/kg～100 μg/kg时，回收率为70%～120%。详见表B.2。质量控制和质量保证空白试验每20个样品或每批次（少于20个样品/批）应至少分析1个空白试验，空白中金刚烷胺的浓度应低于方法检出限。校准标准曲线建立应与批样测定同时进行；每20个样品或每批次（少于20个样品/批）应至少分析1个中间点浓度的标准溶液，测定值与该点初始浓度的相对误差应≤30%；金刚烷胺标准曲线的相关系数r一般应大于0.99。平行样每20个样品或每批次（少于20个样品/批）应至少测定一个平行样。平行样测XX果的相对偏差应在±10以内。基体加标每20个样品或每批次（少于20个样品/批）应至少测定一个基体加标样品，金刚烷胺回收率应在70%～120%之间，见附录B。废物处置实验过程中产生的废液和废物应分类收集，集中保管，委托有资质的单位进行处理。

（资料性）

色谱图图A.1、图A.2、图A.3给出了金刚烷胺标准溶液色谱图、空白样品色谱图和加标样品色谱图。金刚烷胺标准溶液色谱图（10.0 µg/L）空白样品色谱图金刚烷胺加标样品色谱图（金刚烷胺添加量为5.0 µg/kg）

（资料性）

方法的准确度方法精密度和正确度汇总数据见表B.1、表B.2。空白样品加标方法精密度序号名称加标量µg/kg实验室内相对标准偏差%实验室间相对标准偏差%重复性限rµg/kg再现性限Rµg/kg1大菱鲆101.962.631.010.85502.593.064.653.681002.503.339.587.282刺参101.772.931.050.94503.973.404.983.691002.853.408.977.983海带103.873.341.030.82502.282.155.023.651002.192.899.268.264南美白对虾102.542.711.040.86504.603.315.134.981003.363.059.648.265四角蛤蜊104.014.251.060.75503.476.385.264.951005.876.178.797.69空白样品加标方法正确度序号名称加标量µg/kg加标测定平均值µg/kg加标回收率%加标回收率最终值%1大菱鲆109.5495.495.4±1.875048.496.796.7±2.5110094.194.194.1±2.362刺参109.3393.393.3±1.655046.292.592