生物化学实验课件-3蛋白质的盐析分离和凝胶排阻层析脱盐

实验三

蛋白质的盐析分离和

凝胶排阻层析脱盐盐析法粗分离蛋白质凝胶排阻层析法将盐和蛋白质分开紫外分光光度法和醋酸钡法分别测定蛋白质和盐离子浓度，鉴定脱盐是否成功实验目的及要求掌握盐析分级分离蛋白质的原理掌握凝胶排阻层析的原理熟悉盐析、凝胶排阻层析及紫外分光光度法测定蛋白质含量的操作在蛋白质分子表面的亲水基团附近，水分子形成水化层，有利于蛋白质溶解在蛋白质分子表面的疏水基团附近，水分子极化排列，避免蛋白质聚集蛋白质分子表面的可解离基团在适当的pH条件下，与周围溶液中电荷相反的盐离子间形成稳定的双电层，使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间相互作用增强

蛋白质溶解的原理蛋白质在水溶液中的溶解度由蛋白质周围亲水基团与水形成水化层的程度,以及蛋白质分子带有电荷的情况决定盐析沉淀定义

蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低、发生沉淀的现象原理1.中性盐比蛋白质具有更强的亲水性，因此将与蛋白质争夺水分子，使蛋白质脱去水化层2.高浓度盐离子使蛋白质表面所带的电荷被中和，双电层厚度降低，静电排斥作用减弱，蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出盐析的影响因素

蛋白质的种类：

分子量越大，沉淀所需盐的量越少（卵球蛋白>卵清蛋白）蛋白质分子不对称性越大，越容易沉淀

温度：

高离子强度溶液中，升高温度有利于蛋白质的失水沉淀低离子强度溶液或纯水中，蛋白质的溶解度在一定温度范围内一般随温度升高而增大

pH值：

在接近蛋白质等电点的溶液中进行盐析有利于蛋白质的沉淀。需要注意在高盐溶液中蛋白质的等电点会发生偏移盐析的用盐要求盐析作用强足够大的溶解度，适于低温操作生物惰性，不会使蛋白质变性密度小且来源丰富

硫酸铵价廉，易于提纯，盐析效果好溶解度高（4M）沉淀的高浓度蛋白质性质稳定(2-3M)

阻止蛋白水解

蛋白质的层析分离定义：根据蛋白质的形态、大小和电荷的不同而设计的蛋白质物理分离方法，又名色谱法。原理：

各种不同的层析方法都包括一个固定相和一个流动相。当蛋白质混合溶液或气体(流动相)通过装有重填材料的管或柱(固定相)时，由于混合物中各组份在物理化学性质(如吸引力、溶解度、分子的形状与大小、分子的电荷性与亲和力)等方面的差异使各组分在两相间进行反复多次的分配而得以分开固定相：常用交联葡聚糖凝胶，如Sephadex系列，有不同凝胶孔径可供选择流动相：蛋白质混合溶液及冲洗缓冲液凝胶排阻层析(分子筛层析、分子排阻层析、凝胶过滤层析)实验原理：按照分子量大小依次分离混合蛋白质

每个凝胶珠都有一定孔径大小。含有不同大小的蛋白质混合样品流入凝胶柱后，大分子量物质不能进入凝胶珠内部，而沿凝胶珠之间的间隙穿行，迅速流出；小分子量物质进入凝胶珠内部反复穿行，缓慢流出。固定相流动相实验简述通过盐析法使鸡蛋卵清蛋白和卵球蛋白分离；通过盐溶法使沉淀析出的卵球蛋白再次溶解制备葡聚糖凝胶SephadexG-25凝胶排阻层析柱通过凝胶排阻层析分离卵球蛋白和盐离子检测层析后收集的各管样品中的盐离子（醋酸钡法）检测各管样品中的蛋白质含量（UV法）分析结果：盐析分离蛋白及凝胶排阻层析脱盐是否成功？实验一卵球蛋白的盐析分离0.7ml卵清+0.7ml饱和硫酸铵溶液（每组2个EP管）混合均匀（避免产生气泡）静置3-5分钟，蛋白质析出3000rpm，离心3分钟用移液枪去除上清（含卵清蛋白）1ml水充分溶解卵球蛋白沉淀3000rpm,离心3分钟将两管上清合并，即为样品加50%硫酸铵溶液1.5ml洗涤3000rpm，离心3分钟用移液枪去除上清实验二凝胶柱的制备和蛋白脱盐垂直固定层析柱，并安装乳胶管、止水夹向层析柱中加入1/3体积的水，以平衡、排出基质和乳胶管中的气泡；若层析柱流水不畅，应反复正反冲洗柱基质！！液面降至基质上2cm后，用止水夹关闭水流将葡聚糖凝胶混悬液缓慢匀速倒入层析柱中，使凝胶自然沉降，柱高25-30cm左右，注意装填均匀，无气泡和裂纹打开止水夹，加入1-1.5倍体积的水以平衡层析柱，直至液面到凝胶床表面后关闭止水夹用滴管均匀上样，打开止水夹，在下端用EP管接住流出液体待蛋白样品完全进入层析柱后，加入水继续洗脱蛋白，注意加水速度恒定，以保持洗脱压强一致。EP管标记顺序，1.5ml/管收集洗脱液。待盐离子浓度降为零后，停止洗脱。凝胶柱装填和使用过程中，保持凝胶面上有水，否则气泡进入将影响实验结果样品溶液的浓度大一些好，但粘度不宜大，加样体积通常为凝胶柱床体积的1%-10%洗脱速度要恒定实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次实验使用，严禁将凝胶丢弃或倒入水池中凝胶柱的制备和蛋白脱盐注意事项实验三脱盐后离子测定及蛋白浓度测定测定分步收集的样品液（1.5ml样品+1.5mlH2O）的A280吸光度，绘制蛋白脱盐洗脱曲线2.蛋白浓度测定

醋酸钡与溶液中的硫酸根离子可以形成白色的沉淀，同时不能同蛋白质形成沉淀。1.硫酸根离子浓度测定（决定是否停止洗脱）

从每管洗脱液中取1滴加在黑瓷板上，加入1滴醋酸钡溶液，观察沉淀实验中设阴性对照(双蒸水)和阳性对