生物化学实验020649

生物化学实验

目录实验一、酪蛋白的制备

实验二、酵母蔗糖酶的提取及活力测定

实验三、考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度

实验四、DNS-Cl法测定N末端氨基酸

实验五、凝胶过滤层析分离蓝葡聚糖和重铬酸钾实验六、酵母RNA的分离及组分鉴定实验七、维生素C的定量测定实验八、氨基酸纸层析

准备实验

（熟悉实验室规章制度及注意事项；实验记录/报告；基本操作)

1.实验要求

1）充分做好实验预习，写预习报告；

2）按时进实验室；

3）认真做实验；

4）实验记录必须真实可靠、不得捏造。实验数据要记录在数据本上以备老师查阅；

5）保持实验室的秩序，不要喧哗。

2.

关于实验报告

要用自己的实验记录认真地写出一份实验报告，不得互相抄袭。实验报告的内容:①

实验名称②实验目的③实验原理（要写得简洁）④较复杂试剂的配方⑤

实验结果及其处理

⑦分析讨论⑧同组者姓名

标准的实验报告应该简洁明了地给出使别人能够重复你的实验所需要的全部信息。

3.值日生职责：卫生、水、电、门、窗

4.仪器的爱护：

仪器分发及损坏赔偿责任

实验一、酪蛋白的制备

[实验目的]

学习从奶粉中制备酪蛋白的原理和方法，并以此加深对等电点概念的印象。

[原理]

奶粉的主要干物质成分是酪蛋白——一些含磷蛋白质的混合物。酪蛋白的pI为pH4.7。在处于其pI时，兼性离子/粒子在溶液中的溶解度最低；将牛奶的pH调到pH4.7，就可获得酪蛋白沉淀；用乙醇、乙醇-乙醚混合物、乙醚来洗涤沉淀物，以去除醇溶性和脂溶性杂质，就可得到较纯的酪蛋白。

[操作步骤]

40ml每次水洗后（10ml左右/次）离心机试纸10min(4000rpm)25min(4000rpm)10ml4g奶粉+37mL水离心机冷冻离心机高速台式离心机干燥箱恒温水浴锅仪器干燥器实验二、酵母蔗糖酶的提取及活力测定1.学习蔗糖酶分离提取的原理；2.学习掌握细胞破碎及抽提技术一、酵母蔗糖酶粗制品的提取二、蔗糖酶活力测定

1）细胞破碎：根据酶在生物体内的分布，可分为胞内酶和胞外酶，蔗糖酶系胞内酶。提取胞内酶时，要破碎组织和细胞，然后用一定的溶液提取，得到的材料称为无细胞抽提液。材料不同，破壁的方法也不同。本实验酵母细胞破壁方法是：自溶法，即将菌体放在适当的pH值和温度下，利用组织细胞自身的酶系将细胞壁破坏，使细胞内的物质释放出来。自溶时需加少量防腐剂，以防外界细菌污染。自溶法的缺点是时间较长。

研磨法:10g酵母，加入2-3g硼砂，逐步加入0.2mol/L醋酸钠缓冲液，pH4.6，充分研磨50-60分钟。4000转／分离心20分钟，合并，记录总体积，此即为蔗糖酶的粗制品。

（留样用于下次定量实验）

2）抽提：

抽提是将已破碎细胞的材料置于一定的条件及溶剂中，使被提取物释放出来的过程。抽提液可用水或有机溶剂。大部分酶蛋白能溶于水、稀盐、稀碱或稀酸中。对于普通的酶多采用缓冲液，有利于酶的稳定。而一些与脂质结合较牢固的酶，常用有机溶剂提取。抽提时缓冲液的离子强度和pH值以及温度的选择，应既有利于酶的提取又保证酶的稳定。对于不同来源的酶，通常采用盐析沉淀、吸附层析、离子交换层析、结晶及各种物理化学方法提纯。纯化过程中，应尽量避免高温，剧烈的机械搅拌、强酸、强碱等条件。实验原理

1）蔗糖酶催化的反应：蔗糖D-果糖+D-葡萄糖

2）3，5-二硝基水杨酸比色定糖的原理:

①DNS试剂+还原糖

糖酸+氨基化合物

（天蓝色）

（棕红色）②在一定范围内，还原糖的量与反应液的颜色强度成一定比例关系。所以，可用DNS比色法测定还原糖的含量，该方法是半微量定糖法，操作简便、快速、杂质干扰少。

本实验中规定:在35℃条件下，每三分钟能使5%蔗糖溶液水解释放1毫克还原糖的酶量定为一个活力单位。

沸水浴中强碱性溶液中反应式1、试剂：（1）5mmoL/L磷酸钠缓冲液（pH6.0）（2）0.2mol/L醋酸钠缓冲液，pH4.6（3）1moL/L氢氧化钠（4）5%蔗糖（5）3，5-二硝基水杨酸试剂（6）0.1%葡萄糖标准液2、器材：（1）烧杯、搅拌棒、三角瓶、滴管（2）量筒、移液管、吸耳球、试管（3）天平（4）离心机、内外套管（5）冰箱（6）高活性干酵母粉、硫酸纸、皮筋套试剂和器材

操作---葡萄糖标准曲线制作和蔗糖酶活力的测定管号含糖量（mg）0.1%葡萄糖（mL）水（mL）DNS(mL)OD54010021.520.20.21.81.530.40.41.61.540.60.61.41.550.80.81.21.561.01.01.01.571.21.20.81.581.41.40.61.591.61.60.41.510对照（2份）0.5(见后操作)1.51.511样液（3份）0.5(见后操作)1.51.5测定蔗糖酶活力的流程（1）、水解

对照管（2份）

样液（2份）反应:

2ml稀释的酶液×1

×2×52ml稀释的酶液

于35℃恒温水浴中预热到恒温35℃

同时于35℃恒温水浴中准确反应3min加入0.5ml1mol/L的NaOH

，摇匀，使酶失活加入2ml5%蔗糖液（预热至35℃）加入2ml5%蔗糖液（预热至35℃）刻度管1刻度管2各加入1.5mlDNS试剂各加入1.5ml蒸馏水同时于沸水浴中准确反应5min用流动的冷水终止反应分别用离子水定容至25ml同时于35℃恒温水浴中准确反应3min加入0.5ml1mol/LNaOH，摇匀，终止反应取出0.5ml取出0.5ml

分别于540nm处测定光吸收值（2）、比色反应葡萄糖标准曲线制作：以葡萄糖含量（mg）为横坐标，光密度值为纵坐标做出标准曲线。蔗糖酶活力的测定计算出所有的酶在35℃下，以5％蔗糖为底物时，3分钟能释放出的还原糖的总毫克数，此数值即为总活力单位。附:722型分光光度计的操作方法及注意事项：

（1）基本部件：

(2)原理：A=εcl（3）操作方法：①接通电源，打开比色皿暗厢盖，预热20分钟；②旋扭旋至[T]档，调节波长旋扭至所需要的单色光波长，选择相应的放大灵敏度档，再用零位电位器校正电表指针指在零位；③将装有空白液和待测液的比色皿依此放入暗厢内的比色皿架上，此时空白液应位于光路上。盖上暗厢，使光电管见光，旋转光量调节器，使电表指针正确处于100%；④按上述方法连续几次调整零位和使电表指针指在100%，即可进行测定；⑤将旋扭旋至[A]档，此时，若不为0，则调节消光零旋钮。轻拉比色皿定位装置的拉杆，使待测溶液进入光路，此时即可直接读出光吸收值的读数。

（2）注意事项：①务必保持比色皿透光面的清洁，不要用手摸比色皿的光滑面，更不要用毛刷刷洗比色皿，以免影响读数的准确；②比色皿外边沾有水或待测溶液时，可先用滤纸吸干，再用擦镜纸擦净；③把比色皿放入比色皿架时，要注意尽量使它们的位置前后一致。

分光光度计紫外可见分光光度计

实验三、考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度实验目的

学习考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理和方法。实验原理

考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度是利用蛋白质与染料结合的原理，定量地测定微量蛋白质浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝G250存在两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它考马斯亮蓝通过范德华力与蛋白质结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律。结合后染料颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白的量。蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2分钟即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1小时。之后，蛋白-染料复合物发生聚合并沉淀出来。测定蛋白质浓度时灵敏度很高，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10-100ug蛋白质，微量测定范围是1-10ug蛋白质。此法重复性好，精确度高，线性关系好。此方法干扰物少。研究表明NaCl,KCl,MgCl2,乙醇,(NH4)2SO4无干扰。强碱缓冲剂在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。Tris，乙酸，2-巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如TritonX-100,SDS,玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当缓冲液对照很容易除掉。但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。

1.器材试管及试管架吸量管（0.1mL,5mL）分光光度计

2.试剂（1）考马斯亮蓝试剂:考马斯亮蓝G250100mg溶于50mL95%乙醇中，加入100mL85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL，滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G250,4.7%乙醇，8.5%磷酸。（2）标准蛋白质溶液：结晶牛血清清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15mol/LNaCl配置成0.1mg/mL蛋白溶液。（3）未知蛋白质溶液器材和试剂操作步骤

1.制作标准曲线

试管编号0123456标准蛋白/mL00.10.20.30.40.50.60.15mol/LNaCl/mL1.00.90.80.70.60.50.4考马斯亮蓝试剂/mL5.0摇匀，1h内以0号试管为空白对照，在595nm处测吸光值A595

2.测定未知样品蛋白浓度

测定方法同上，取合适体积的未知样品，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品蛋白浓度。

结果与讨论绘出标准曲线求出未知蛋白浓度1.如果测定要求很严格，可以再试剂加入后5-20分钟内测定光吸收，因为在这段时间内颜色最稳定。2.测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。注意事项实验四、DNS-氨基酸的聚酰胺薄膜层析

一、目的学习聚酰胺薄膜层析的方法。二、原理

荧光试剂二甲氨基萘磺酰氯即DNS-Cl(Dansyl-Cl)，能与所有氨基酸的氨基结合，生成荧光物质DNS-氨基酸。DNS-Cl也能与蛋白质或多肽的游离氨基结合，生成DNS-蛋白质或DNS-肽，经酸水解后可释放出DNS-氨基酸。各种DNS-氨基酸与聚酰胺薄膜形成氢键的能力不同，即在溶剂与聚酰胺薄膜之间的分配系数不一样，故可用聚酰胺薄膜层析分离各种DNS-氨基酸。检测灵敏度高（0.01ug），分辨力强，快速方便。

DNS-氨基酸在360nm或280nm波长的紫外光照射下，发出黄绿色荧光，容易进行检测。三、器材和试剂1.器材层析缸毛细管紫外灯烘箱恒温箱聚酰胺薄膜吹风机2.试剂①各种层析纯标准氨基酸②DNS-Cl丙酮溶液：称取25mgDNS-Cl，溶于10mL丙酮中，贮于棕色瓶中，置冰箱保存，一个月内稳定③0.2mol/LNaHCO3溶液④NaOH1M⑤HCL1M⑥展开溶液I：88％甲酸：水＝1.5:100（V/V）⑦展开溶液Ⅱ：苯：冰醋酸=9:1（V/V）⑧展开溶液Ⅲ：乙酸乙醋：甲醇：冰醋酸=20:1:1（V/V/V）⑨展开溶液Ⅳ：0.05mol/L磷酸三钠溶液：乙醇＝3:1（V/V）四、操作1．氨基酸的DNS化分别称取0.2～0.3mg的层析纯标准氨基酸以及样品氨基酸，溶于0.5mL0.2mol/L的NaHCO3溶液中。各取0.1mL于有玻璃塞的试管中，加入0.1mLDNS-Cl丙酮溶液。检查pH，必要时用NaOH调pH至9.0—9.5。于室温（20℃左右）放置2～4h。冷风吹除丙酮后，加HCL调pH2-3水解16-18h，加入乙酸乙酯抽提分层，取上层有机相。2．聚酰胺薄膜的准备将聚酰胺薄膜剪成7cm×7cm的方块，在距边0.5cm处画互为垂直的二条基线，交叉点为原点。若只做单向层析，则只画一条基线，在基线上每隔1cm画一点样点。3．点样用微量注射器或毛细管取样，点在点样位置上，点样直径应小于2mm。若多次点样，则点一次，吹干一次。4．展开将点好样的聚酰胺薄膜卷成圆筒形，样品侧在筒内，箍以线圈固定。放在小层析槽内（可在小干燥器内置一培养皿代替），槽内（培养皿）放人5～10mL展开溶液I，进行展开，以溶剂前沿到达距顶端0.5cm左右为止（约20分钟）。取出膜片，吹干。进行双向层析时，在第一向层析完毕，完全吹干后（有时需晾过夜，才能充分吹干），将聚酰胺薄膜片转90°，用展开溶液Ⅱ展开。为了区分DNS-苏氨酸、DNS-天冬氨酸与DNS-谷氨酸，可在溶液Ⅱ展开后，吹干，接着用溶液Ⅲ沿同一方向展开，只需展开至一半高度即可。为了区分ε-DNS-赖氨酸、α-DNS-组氨酸与DNS-精氨酸，应在溶剂Ⅱ中展开后，吹干，接着在溶液Ⅳ中沿同一方向展开。5.DNS-氨基酸的检测展开结束后，取出薄膜，用吹风机吹干，在360nn或280nn的紫外光灯下检测。DNS氨基酸呈黄绿色荧光。此外还有其他颜色的杂点，如DNS-OH显蓝绿色荧光等。用样品的层析谱与标准DNS-氨基酸层析谱相比较，可鉴别样品DNS-氨基酸的种类。Coverthebeakerwithawatchglass,swirlitgently,andallowittostandwhileyouprepareyourTLCplate.

Usingapencil,drawalineacrosstheplateatthe0.5cmmark.Thisistheorigin:thelineonwhichyouwill"spot"theplate.It'skindofhardtoseethepencillineintheabovephotos,sohereisaclose-upofhowtheplatelooksafterthelinehasbeendrawn.dipthemicrocapintosolution-thearrowpointstothemicrocap,itistinyandhardtosee

makesureitisfilled-holdituptothelightifnecessary

touchthefilledmicrocaptoTLCplatetospotit-makesureyouwatchtoseethatalltheliquidhasdrainedfromthemicrocap

Developtheplate.placetheTLCplateinthedevelopingcontainer-makesurethesolventisnottoodeepThesolventwillriseuptheTLCplatebycapillaryaction.Inthisphoto,itisnotquitehalfwayuptheplate.Inthisphoto,itisabout3/4ofthewayuptheplate.Removetheplatefromthebeaker.quicklymarkalineacrosstheplateatthesolventfrontwithapencilAllowthesolventtoevaporatecompletelyfromtheplate.Ifthespotsarecolored,simplymarkthemwithapencil.herearetwopropersizedspots,viewedunderaUVlamp

(youwouldcirclethesewhileviewingthem)Theplateshowsthreecompoundsrunatthreedifferentconcentrations.Themiddleandrightplateshowreasonablespots;theleftplateisruntooconcentratedandthespotsarerunningtogether,makingitdifficulttogetagoodandaccurateRfreading.

Here'swhatoverloadedplateslooklikecomparedtowell-spottedplates.Theplateonthelefthasalargeyellowsmear;thissmearcontainsthesametwocompoundswhicharenicelyresolvedontheplatenexttoit.TheplatetothefarrightisaUVvisualizationofthesameoverloadedplate.Theretentionfactor,orRf,isdefinedasthedistancetraveledbythecompounddividedbythedistancetraveledbythesolvent.扩展剂A结果扩展剂B结果与形成氢键能力，及DNS-aa在扩展剂中的溶解度有关实验五、凝胶过滤层析

分离蓝葡聚糖和重铬酸钾

1.了解凝胶过滤层析的原理及其应用

2.初步掌握凝胶过滤层析技术实验目的

实验原理

凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。它广泛地应用于分离、提纯、浓缩生物大分子及脱盐等。凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状颗粒物质。用它来分离物质，主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子（近于球形）具有不同的排阻效应实现的。亦即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。凝胶过滤层析的工作原理对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走。分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。动画器材与试剂

（一）器材

1.玻璃层析柱(20mm×40cm）

2.恒流泵

3.自动部分收集器

4.250ml烧杯（二）试剂

1.蓝葡聚糖－20002.重铬酸钾实验操作

（一）凝胶的溶胀

7gSephadexG-75于250ml烧杯中加入H2O100ml，沸水浴中煮沸2～3小时（可去除颗粒内部的空气及灭菌）,反复倾泻去掉细颗粒。（二）装柱

1.取洁净的的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。

2.在柱中注入H2O（约1/3柱床高度），将凝胶浆液缓慢倾入柱中，待凝胶沉积约1cm～2cm高度后打开出水口，流速一般用3ml～6ml/10min。胶面上升到柱记号处则装柱完毕，注意装柱过程中凝胶不能分层。然后关闭出水口，静置片刻，等凝胶完全沉降，则接上恒流泵，用1～2倍床体积的洗脱液平衡柱子，使柱床稳定。

(三)上样

0.1ml样品加到凝胶柱床表面，洗下残留样品。

(四)洗脱打开恒流泵，用水作为洗脱液洗脱，观察。装置图层析装置

实验六、酵母RNA的分离及组分鉴定[实验目的]

了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸的方法。

[原理]

酵母核酸中RNA含量较多，达2.67-10.0%，DNA含量仅为0.03-0.516%。在细胞中除了核酸外还有Pr、多糖及其他多种化合物；RNA可溶于碱性溶液，在碱性提取液中加入酸性乙醇溶液可以使RNA析出；稀减法使用稀碱（0.04MNaOH）裂解酵母，然后用酸中和，除去蛋白质等的上清液用乙醇沉淀或调pH2.5，利用等电点沉淀。提取的RNA有不同程度的降解。RNA提取的操作步骤10g干酵母研磨60mlNaOH100ml锥形瓶）沸水浴30m’（搅拌）冷却后离心4000rpm,10m’。取上清，倒入20ml酸性乙醇中，边加边搅，待完全沉淀后，离心（4000rpm,3分钟）。沉淀用95%乙醇洗2次（每次约10ml），再用无水乙醚洗1次（7ml），洗涤时用细玻棒小心搅动沉淀。室温干燥得RNA粗品。

RNA是由核糖、嘌呤/嘧啶碱和磷酸组成的。提取得到的0.1gRNA中加10%硫酸5ml，煮沸10min即可得到水解液，对它们分别进行定性鉴定。①磷酸与钼酸铵试剂作用产生蓝色物质(1ml水解液+1mlAgNO3+1ml钼酸铵→水浴加热)：(NH4)2MoO4+H3PO4→(NH4)3PO4·12MoO3黄色物质②核糖与苔黑