《生物化学实验》课件021919

生物化学实验

Biochemical

Experiment1完整版课件ppt

生物化学实验技术理论2完整版课件ppt一、层析技术1903年，俄国科学家M.C.Jber首创了一种从绿叶中分离多种不同颜色色素成分的方法，命名为色谱法(Chromatography)，由于翻译和习惯的原因．又常称为层析法。80多年来，层析法不断发展，形式多种多样。50年代开始，相继出现了分配层析、离于交换层析、凝胶层析、亲和层析、吸附层析等。几乎每一种层析法都已发展成为一门独立的生化高技术，在生化领域内得到了广泛的应用。3完整版课件ppt一、层析技术1、层析技术原理2、层析技术分类3、常用层析技术原理4完整版课件ppt1、层析技术原理层析原理：是一种物理的分离方法，利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一相为固定相，另一相流过此相称作流动相，并使各组分以不同速度移动，从而达到分离的目的。可分离物质：糖类、有机酸、氨基酸、核苷酸。5完整版课件ppt2、层析技术分类名称操作方式固定相流动相分离依据分配层析纸层析薄层层析液体液体溶解度离子交换层析离子交换柱层析固体液体带电性静电引力吸附层析吸附薄层层析气体吸附层析固体固体液体气体吸附力亲合层析酶与底物抗原与抗体固体液体配体专一性凝胶层析凝胶过滤固体液体分子大小6完整版课件ppt3、常用的层析原理（1）分配层析——纸层析原理：溶质在互不相溶的两相中溶解度不同，在终点时达到一种平衡，其比值为一个常数，即分配系数（α）。

固定相内溶质的浓度

α=

流动相内溶质的浓度固定相：滤纸上吸附的水流动相：有机溶剂（正丁醇）7完整版课件ppt1286464326432164848168324832842040402042123040301228完整版课件ppt纸层析纸层析是最简单的液一液相分配层析。滤纸是纸层析的支持物。当支持物被水饱和时，大部分水分子被滤纸的纤维素牢牢吸附，因此，纸及其饱和水为层析的固定相，与固定相不相混溶的有机溶剂为层析的流动相。对某些特定化合物，在特定的展层系统，一定的温度条件下，Rf是个常数。9完整版课件ppt（2）离子交换层析原理：将能与周围介质进行离子交换的不稳定离子固定于惰性基质上，从而分离介质中的组分。常用的惰性基质：人工合成树脂（单体：苯乙烯、交联剂：二乙烯苯）阳离子交换剂：磺酸甲基、羧甲基、磷酸基阴离子交换剂：二乙基胺乙基、三乙基胺乙基可交换离子：阳离子：Na+、H+

阴离子：Cl-、OH-10完整版课件ppt示意图（交换树脂表面）11完整版课件ppt示意图（离子交换过程）电离基团（磺酸根）可交换离子（钠离子）交换离子不交换离子12完整版课件ppt示意图水分子B物质A物质13完整版课件ppt（3）吸附层析原理：当气体或液体中某组分的分子在运动中碰到一个固体表面时，分子会贴在固体表面上并停留一定时间然后才离开，此为吸附现象。吸附现象形成的原因：吸附作用可能由几种作用力形成，包括被吸附物与吸附剂之间相反电荷基团与基团之间的静电引力(形成离子键)、氢键及范德华引力等。在不同条件下，占主要地位的作用力可能不同，也可能几种力同时起作用吸附剂：氧化铝、活性炭、硅胶；纤维素、淀粉、聚酰胺；滑石、陶土、粘土。14完整版课件ppt吸附层析示意图

吸附剂易吸附分子不易吸附分子15完整版课件ppt（4）亲和层析原理：利用分子间具有专一亲和力而设计的层析技术。专一亲和力分子对：酶与底物、特异性抗原与抗体、DNA和RNA、激素和其受体载体：使亲和物固相化的水不溶性化合物。如：纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、聚苯乙烯、乙烯、多孔玻璃。16完整版课件ppt17完整版课件ppt（5）凝胶过滤原理：被分离物质因分子大小不同，在凝胶中向下移动的速度不同。物质进入凝胶柱之后有两种运动方式：垂直向下移动和无定向的扩散运动。大分子物质直径大无法进入凝胶颗粒内，只能分布于颗粒间隙中向下移动快，而小分子物质可扩散到凝胶颗粒内，因此向下移动慢。凝胶物质：马铃薯淀粉凝胶、琼脂、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶。18完整版课件ppt19完整版课件ppt电泳技术一.电泳的概念二.电泳技术分类三.电泳技术基本原理四.几种常见电泳方法的比较五.聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理20完整版课件ppt一.电泳的概念带电质点在电场中移动的现象。21完整版课件ppt二.电泳技术分类22完整版课件ppt三.电泳技术基本原理1.基本原理

不同的带电颗粒在同一电场中泳动速度，主要与其所带净电荷量，分子量及分子形状有关。pH>pI分子带负电荷,在电场中向正极移动;

pH<pI分子带正电荷,在电场中向负极移动;

泳动度u=v=d/t=dleV/lVt23完整版课件ppt2.影响电泳速度的因素(1)电场强度泳动速度与电场强度成正比常压电泳(100—500V).2—10V/cm，几小时或几天；蛋白质等大分子物质;高压电泳(500—1000V).20—200V/cm，几分钟；氨基酸、小肽、核苷酸等小分子物质;（2）溶液的pH值pH距待分离物质的pI越远，泳动速度越大；（3）溶液离子强度离子强度越小,电动势越大,泳动速度越快。（4）电渗现象：在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。24完整版课件ppt四.几种常见电泳的比较类型优点缺点纸电泳设备操作简单分辨率差，电渗现象醋酸纤维薄膜电泳设备操作简单，样品用量少分辨率差琼脂糖凝胶电泳快速，分辨率高电渗现象严重聚丙烯酰胺凝胶电泳可调节凝胶孔径，样品用量少分辨率高，无电渗现象高浓度凝胶难剥离25完整版课件ppt五.聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理1.原理具有电泳和分子筛的双重作用2.聚丙烯酰胺凝胶的聚合单体：丙稀酰胺（Acr）交联剂：甲叉双丙稀酰胺交联剂(Bis)

催化剂聚合形成的三维网状结构。OCH2=CH-C-NH2OOCH2=CH-C-NH

-CH2-NH-C-CH=CH226完整版课件ppt五.聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理2.聚丙烯酰胺凝胶的聚合催化剂（1）过硫酸铵-TEMED系统碱性条件下催化作用温度与聚合快慢成正比（2）核黄素-TEMED系统光激发的催化反应用量少，对分析样品无影响聚合时间可自由控制27完整版课件ppt五.聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理3.聚丙烯酰胺凝胶的孔径凝胶越浓T，凝胶孔径↓，所受阻力，机械强度

丙稀酰胺浓度分离物质分子量4％大于100万7－7.5％1－100万15－30％小于1万胶的孔径为蛋白质分子平均大小一半时效果好凝胶强度的选择先用7.5%的标准凝胶或4%--10%的凝胶梯度测试28完整版课件ppt

五.聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理

4.缓冲系统的选择

pH、离子种类和离子强度酸性蛋白质高pH碱性蛋白质低pH连续和不连续系统电泳槽中的缓冲系统和pH与凝胶相同电泳槽中的缓冲系统和pH与凝胶相同，分辨率高29完整版课件ppt

五.盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳原理（1）盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的四个不连续性

A.凝胶层的不连续性浓缩胶T=2.8％C=20%；分离胶T=7％C=2.5%

B.缓冲液成分的不连续性：凝胶缓冲液Tris-HCl,含Cl－，电极缓冲液Tris-Gly,Gly－

C.pH的不连续性：浓缩胶pH6.7,分离胶pH8.9，电极缓冲液pH8.3

D.电位梯度的不连续性30完整版课件ppt五.盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳原理（2）盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种效应

样品的浓缩效应电荷效应分子筛效应31完整版课件pptA.样品的浓缩效应缓冲液成分及pH的不连续性浓缩胶pH6.7缓冲液浓缩胶Tris-HCl,电极缓冲液Tris-Gly解离度：

Cl>

蛋>

Glymcl

cl>m蛋

蛋>mGly

Gly凝胶中Cl－为快离子，Gly－为慢离子，蛋白质样品被夹在中间。缓冲液样品浓缩胶分离胶32完整版课件ppt缓冲液成分及pH的不连续性导致蛋白质样品

浓缩效应示意图

快离子慢离子蛋白质样品

33完整版课件ppt

E：每厘米的电压降E＝I(电流强度)/(电导率)E与电泳速度成正比电泳开始后，由于快离子泳动率最大，在快离子后面形成一个离子浓度低的低电导区，产生较高的电位梯度，使蛋白质和慢离子加速移动，蛋白质样品被进一步浓缩。电位梯度的不连续性34完整版课件pptE：每厘米的电压降E＝I(电流强度)/(电导率)E与电泳速度成正比电泳开始后，由于快离子泳动率最大，在快离子后面形成一个离子浓度低的低电导区，产生较高的电位梯度，使蛋白质和慢离子加速移动，蛋白质样品被进一步浓缩。

电位梯度的不连续性35完整版课件pptA.

样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括：缓冲液成分及pH的不连续性电位梯度的不连续性缓冲液浓缩胶样品分离胶36完整版课件pptA.样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括：凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3)蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。缓冲液样品浓缩胶分离胶37完整版课件pptA.样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括：凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3)蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。缓冲液样品浓缩胶分离胶38完整版课件pptA.样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括：凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3)蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。缓冲液浓缩胶分离胶39完整版课件pptA.样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括：凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3)蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。缓冲液浓缩胶分离胶