T-JAASS 144-2024 土壤微生物胞外酶活性测定荧光法

ICS65.020.99JAASSDeterminationofsoilmicrobialextracellularenzymeactivityFluorescencemethodIT/JAASS144—2024前言 2规范性引用文件 3术语和定义 4原理 25土壤采集和试剂配制 26实验仪器 37具体操作 38结果计算 4附录A（资料性）MUB或AMC标准曲线配制 5T/JAASS144—2024本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由江苏省农学会提出并归口。本文件起草单位：宁波大学、宁波市鄞州区农技推广站、中国科学院南京土壤研究所、宁波（北仑）中科海西产业技术创新中心。本文件主要起草人：祝贞科、葛体达、王先挺、张广斌、李刚、刘琼、张昊青、魏亮。1T/JAASS144—2024土壤微生物胞外酶活性测定荧光法本文件描述了土壤微生物胞外酶活性利用微孔荧光法的测定方法。本文件适用于使用微孔荧光法检测土壤中与碳、氮、磷循环相关的关键水解酶活性，且酶底物荧光指示剂需是4-甲基伞形酮或7-氨基-4-甲基香豆素。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。CB/T603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备GB7172土壤水分测定法GB/T32722土壤质量土壤样品长期和短期保存指南GB/T36197土壤质量土壤采样技术指南HJ613土壤干物质和水分的测定重量法T/GSSF004土壤样品采集、制备及保存技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1β-1.4-葡萄糖苷酶β-1.4-Glucosidase：BG是一种碳降解酶，在碳循环过程中降解β-1.4-葡聚糖和纤维素，将纤维二糖水解为葡萄糖。3.2是一种碳降解酶，碳循环过程中水解低聚木糖生成木糖。3.3纤维二糖葡萄糖苷酶B-D-cellobioside：CBH是一种碳降解酶，碳循环过程中从纤维素分子的非还原端水解纤维二糖二聚体。3.4β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶β-N-acetylglucosaminidase：NAG是一种氮降解酶，氮循环过程中在几丁质和其他β-1.4-连接的氨基葡萄糖聚合物的降解中发挥作3.5亮氨酸氨基肽酶Leucineaminopeptidase：LAP是一种氮降解酶，氮循环过程中从多肽的N端水解亮氨酸和其他疏水性氨基酸。3.6磷酸酶Acidphosphatase：PHOS是一种磷降解酶，磷循环过程中水解磷酸单酯或磷酸二酯，释放出磷酸。3.74-甲基伞形酮4-Methylumbelliferone：MUB是一种水溶性的强荧光染料，在测定过程中，通过酶的催化作用，标记有伞形酮的底物发生分子内消除反应，导致伞形酮脱落，形成与原底物具有不同的光学特征的产物。目前广泛使用的底物有4-甲基伞型酮β-1.4-葡萄糖苷(4-MUB-β-D-glucoside)、4-甲基伞型酮β-木糖苷（4-MUB-β-Xylosidase）、2T/JAASS144—20244-甲基伞型酮纤维二糖苷(4-MUB-β-D-cellobioside)、4-甲基伞形酮乙酰氨基葡萄糖苷(4-MUB-β-N-acetylglucosaminidase)、4-甲基伞形酮磷酸酯(4-MUB-Phosphate)，分别是β-1.4-葡萄糖苷酶、β-木糖苷酶、纤维二糖葡萄糖苷酶、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、亮氨酸氨基肽酶、磷酸酶的荧光指示剂。3.87-氨基-4-甲基香豆素7-Amino-4-methylcoumarin：AMC是一种水溶性的强荧光染料，是亮氨酸氨基肽酶底物特有的荧光指示剂。4原理荧光酶测定使用来自底物荧光的差异来测量酶反应。荧光是当吸收不同波长的光后分子发出一个波长的光，其与特定底物结合时荧光特性消失，当酶分解其特异性底物时，通过酶的水解作用，底物中包含的荧光物质MUB或AMC被释放出来，由于MUB和AMC在365nm波长处激发，在450nm处检测到荧光，进而设定365nm激发波长和450nm检测波长，通过检测其荧光量来表征酶活性。5土壤采集和试剂配制5.1土壤样品采集及保存5.1.1样品采集土壤样品采集应符合GB/T36197和T/GSSF004的规定。5.1.2样品保存采集的样品按照GB/T32722和T/GSSF004的规定4℃储存，7天之内测定。5.2试剂配制试剂应按照GB/T603的规定进行制备。5.2.1标准物——标准物1：MUB称取17.5mgMUB溶于80mL无菌去离子水中，将其转移至100mL棕色容量瓶，用无菌去离子水定容至100mL，浓度为1mmol/L。——标准物2：AMC称取17.5mgAMC溶于80mL无菌去离子水中，将其转移至100mL棕色容量瓶，用无菌去离子水定容至100mL，浓度为1mmol/L。5.2.21MNaOH溶液称取NaOH4.00g溶于80mL无菌去离子水中，将其转移至100mL容量瓶，用无菌去离子水定容到100mL，浓度为1mol/L。5.2.3乙酸钠缓冲液称取乙酸钠6.804g于1L烧杯中，加无菌去离子水至800mL，用冰醋酸或氢氧化钠调节pH至测定样品的适宜值，再将其转移至1L容量瓶中，用无菌去离子水定容至1L，配制成浓度为50mmol/L。pH具体值需要根据采集土壤的pH分布及均值确定，调节至土壤最适pH。5.2.4Tris（三羟甲基氨基甲烷）缓冲液称取6.057gTris碱溶于800mL无菌去离子水中，再将其转移至1L容量瓶中，用无菌去离子水定容至1L，用NaOH溶液调至适宜pH，配制成浓度为50mmol/L。5.2.5不同底物溶液3T/JAASS144—2024——BG酶底物：称取6.77mg4-甲基伞型酮β-1.4-葡萄糖苷溶于80mL无菌去离子水中，再将其转移至100mL棕色容量瓶中，用无菌去离子水定容至100mL，浓度为200μmol·L-1，棕色玻璃瓶保存。——XYL酶底物：称取6.17mgβ-木糖苷溶于80mL无菌去离子水中，再将其转移至100mL棕色容量瓶中，用无菌去离子水定容至100mL，浓度为200μmol·L-1，棕色玻璃瓶保存。——CBH酶底物：称取0.01g4-甲基伞型酮纤维二糖苷溶于80mL无菌去离子水中，再将其转移至100mL棕色容量瓶中，用无菌去离子水定容至100mL，浓度为200μmol·L-1，棕色玻璃瓶保存。——NAG酶底物：称取7.59mg4-甲基伞形酮乙酰氨基葡萄糖苷溶于80mL无菌去离子水中，再将其转移至100mL棕色容量瓶中，用无菌去离子水定容至100mL，浓度为200μmol·L-1，棕色玻璃瓶保存。——LAP酶底物：称取6.5mgL-亮氨酸-7-酰胺基-4-甲基香豆素溶于溶于0.5mL丙酮，再将其转移至100mL棕色容量瓶中，用无菌去离子水定容至100mL，浓度为200μmol·L-1，棕色玻璃瓶保存。——PHOS酶底物：称取5.12mg4-甲基伞形酮磷酸酯溶于80mL无菌去离子水中，再将其转移至100mL棕色容量瓶中，用无菌去离子水定容至100mL，浓度为200μmol·L-1，棕色玻璃瓶保存。5.3淬火标准曲线配制稀释1mmol/L的标准物溶液（MUB或AMC）配制淬火标准曲线。标准曲线浓度为0、2.5、5、10、25、50、100μmol/L（具体配制见附录A）。6实验仪器电子天平，恒温培养箱，加液器，磁力搅拌器，多功能酶标仪。7具体操作7.1悬浊液制备碱性土壤缓冲液适用Tris缓冲液，酸性或中性土壤适用乙酸钠缓冲液。称取1.00g新鲜土壤，放在150mL容器中，加入125mL灭菌冷却后的Tris缓冲液或乙酸钠缓冲液，即为土壤悬浊液，封口加盖，摇床180r/min震荡2h。另根据HJ613和GB7172标准测定土壤含水率。7.2样品添加7.2.1测定样品、空白样品、淬火样品震荡结束后将装有悬浊液的容器放置在磁力搅拌器上，加入磁珠，一边搅拌一边加入200μL土壤悬浊液至96微孔板中，每一个样品做3个重复，吸取5份，随后依次加入50μL5种不同的酶底物溶液，即为测定样品；吸取200μL土壤悬浊液至96微孔板中，每个样品做3个重复，加入50μL缓冲液，即为空白样品；再吸取200μL土壤悬浊液至96微孔板中，分别加入50μL不同浓度的MUB或AMC标曲溶液，每一个样品做3个重复，即为淬火样品。7.2.2标准样品、阴性样品最后另取一个96微孔板加入200μL缓冲液，再加入50μL不同浓度的MUB或AMC标曲溶液，标准曲线每个点8个重复，即为标准样品；再吸取200μL缓冲液，再加入50μL不同的酶底物溶液，即为阴性样品。7.3样品培养悬浊液和酶底物全部加入完成后，将96微孔板置于25℃黑暗条件下培养4h，培养结束后在每个孔中加入10μL1M的NaOH溶液终止反应。注：NaOH溶液不可提前注入等待上机，需注入一板立即测定一板4T/JAASS144—20247.4样品测定用无菌纸擦净酶标板底部，去除凝结物防止影响读数。在多功能酶标仪上，设定激发波长365nm和检测波长450nm，测定每孔的荧光值。8结果计算8.1土壤淬火曲线校正系数土壤中的某些成分如有机质中的胡敏酸导致荧光类物质的淬灭，在计算的过程中，通过引入校正系数，将被土壤淬灭的产生的荧光类物质重新考虑进来，MUB或AMC淬火标准曲线按公式（1）计算：式中：q——土壤淬火曲线校正系数；kh——土壤淬火样品标准曲线斜率；k——土壤标准样品的标准曲线斜率。8.2荧光释放系数将读取的荧光值换算为浓度(μmol）的换算系数，按公式（2）计算：式中：e——荧光释放系数；kh——土壤淬火样品标准曲线斜率；Vh——土壤淬火样品中每个孔加入MUB或AMC的体积（mL）。8.3校正后样品荧光值经过标准曲线校正后的测定样品孔荧光值，按公式（3）计算：F=(f-fb)/q-cs····················································(3)式中：F——校正后的样品荧光值；f——酶标仪读取的测定样品微孔荧光值；fb——酶标仪读取的空白样品微孔荧光值；q——土壤淬火曲线校正系数；cs——酶标仪读取的阴性样品微孔荧光值。8.4土壤酶活性最终所得的土壤样品酶活性，按公式（4）计算：Ab=FV/(eV1tm)··················································(4)式中：Ab——土壤样品酶活性(μmolg-