DB3707T 133-2024 西瓜枯萎病菌鉴定技术规程

ICS65.020.20CCSB16

3707潍 坊 市 地 方 标 准DB3707/T133—2024西瓜枯萎病菌鉴定技术规程Technicalcodeofpracticeforidentificationofwatermelonfusariumwiltpathogen2024-12-19发布 2025-01-20实施潍坊市市场监督管理局  发布DB3707/T133DB3707/T133—2024DB3707/T133DB3707/T133—2024IIIIII目 次前言 II范围 1规范性引用文件 1术语和定义 1鉴定程序 1田间取样 2症状检查 2病原菌的鉴定 3过程记录及档案保存 4附录A（资料性）西瓜枯萎病危害症状 5附录B（资料性）马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）配制方法 6附录C（规范性）西瓜枯萎病菌致病性测定 7附录D（资料性）西瓜枯萎病菌菌落形态及分生孢子形态特征 8附录E（资料性）西瓜枯萎病菌DNA的提取 9附录F（资料性）西瓜枯萎病菌PCR检测 10参考文献 11前 言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由潍坊市农业农村局提出、归口并组织实施。本文件起草单位：优奈尔生物科技有限公司、潍坊郭牌农业科技有限公司、潍坊市农业科学院。杨珊、辛国凤、杨琪、邢石磊。DB3707/T133DB3707/T133—2024DB3707/T133DB3707/T133—2024PAGEPAGE11PAGEPAGE10西瓜枯萎病菌鉴定技术规程范围本文件适用于西瓜枯萎病菌的检测和鉴定。规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。术语和定义SN/T2589-2010界定的以及下列术语和定义适用于本文件。症状 symptom2589—2010，定义3.2]鉴定程序西瓜枯萎病菌鉴定技术规程包括田间取样、症状检查、病原菌的鉴定、过程记录及档案保存4个阶段。程序流程如图1所示。图1 西瓜枯萎病菌鉴定流程图田间取样（但尚未完全枯死4～8症状检查症状检查操作如下:观察病株叶部有无西瓜枯萎病的可疑症状（见附录A），如出现叶片萎蔫、发黄、干枯等。用小刀进行纵切和横切病株根部病健交界处，观察有无西瓜枯萎病的可见症状（见附录A），如基部有褐色条斑或发生表皮纵裂、维管束变褐等。（4病原菌的鉴定实验用仪器设备和主要试剂的准备实验仪器实验仪器包括生物显微镜、超净工作台、高压灭菌锅、高速冷冻离心机、PCR仪、凝胶成像仪、电泳仪、恒温培养箱、-804-20（0.1μL～2.5μL、1μL～10μL、10μL～100μL、20μL～200μL、100μL～1000μL）等。主要试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。——1NaClO7530DNAPCR——试验中除PCR试验所用的试剂配制为三级水外，其他用水均为一级水。——马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）（配制方法见附录B）。病原菌的培养直接培养将样本根部用75%酒精进行消毒处理30s后，用无菌水冲洗3遍，用1%琼脂进行保湿，置于28℃条件下培养2d～4d。分离培养将病株根部或茎部病健交界处切成5mm左右的小块，在1NaClO溶液中浸泡2min，用75%酒精浸泡15s，无菌水冲洗3次，灭菌滤纸片吸干水分后放置在PSA培养基上，用parafilm膜封口，置于28d～3d。用挑针挑取单根菌丝接种到新鲜PSA培养基上纯化培养5d。按照附录C形态学鉴定用灭菌牙签挑取按照7.2条培养获得的菌丝及分生孢子，制成临时玻片，在生物显微镜下观察分生孢子形态特征（见附录D）。病菌在PSA4d～5d分子生物学鉴定PSA5CTAB（见附录E）提取可疑分离物DNA。将提取得到的DNA用ITS1/ITS4、EF1-728F/EF1-986R、CYLH3F/CYLH3R、ACT-512F/ACT-783R作为引物分别扩增病原菌菌株的核糖体内部转录间隔区（thenuclearribosomalinternaltranscribedspacerregion，ITS）、翻译延伸因子（translationelongationfactor1-a，TEF-1）、组蛋白（histoneH3，HIS）、肌动蛋白基因（actingenes，ACT）。将所获得的片段提交测序，并根据参考序列信息构建系统发育树（见附录F），从而确定可疑分离物的种类。结果判定应采用形态学检测和分子生物学鉴定相结合的方法，进行结果判定。分离菌株的培养性状和形态特征符合7.3条描述，且根据ITS、TEF-1、HIS、ACT序列构建的系统发育树，与西瓜枯萎病菌参考菌株序列构建的系统发育树能够聚到一个分支上，且置信度大于95fsp。分离菌株的培养性状和形态特征符合7.3条描述，但根据ITS、TEF-1、HIS、ACT序列构建的系统发育树，与西瓜枯萎病菌参考菌株序列构建的系统发育树，能够聚到一个分支上，但置信度不大于95sp。分离菌株的培养性状和形态特征不符合7.3条描述，可判定未检出西瓜枯萎病菌fsp。病原菌的保存从检测样品中分离并鉴定为西瓜枯萎病菌的菌株应妥善保存。将菌株接种于PSA培养基斜面上，在283d4-80℃超低温冰箱中冷冻保存；或收集菌丝进行真空干燥后于-20℃冰箱中低温保存。试验结果记录（（等；8 过程记录及档案保存（（和（附 录 A（资料性）西瓜枯萎病危害症状d～2d，早晚尚病株症状 b)病株维管束病状图A.1 西瓜枯萎病田间发病症状附 录 B（资料性）马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）配制方法将洗净后去皮的马铃薯200g切成1cm左右的小块，加水1000mL煮沸20min，用4层纱布过滤去除马铃薯泥，然后加入20g蔗糖，融化后定容至1000mL，加入10g～15g琼脂后加热使琼脂完全溶化，将配制好的培养基分装到三角瓶中，塞好棉塞后用牛皮纸袋包裹，置于121℃高压灭菌20min。附 录 C（规范性）西瓜枯萎病菌致病性测定选取疑似枯萎病或者测序结果为枯萎病菌的纯培养菌落，采用浸根法接种。将处于子叶平展期的西瓜苗根系漂洗干净后，在6×106个孢子·mL-1的孢子悬浮液中浸根15min，期间摇动孢子悬浮液3次。对照植株在无菌水中浸根15min。接种后幼苗移栽至经过121℃高压湿热灭菌2h的过筛土和草炭（1:1）混合的基质中。在人工气候室中培养，温度26℃/22℃（日/夜），光照14h/10h（日/夜），相对湿度60%，每个处理接种6株，3次重复，接种3d后剔除萎蔫和枯死的幼苗。接种4d后开始调查记录发病情况，21d内持续观察幼苗发病情况以确认分离菌株的致病性。附 录 D（资料性）西瓜枯萎病菌菌落形态及分生孢子形态特征f.sp.属半知菌亚门真菌。病菌产生三种类型的孢子。病菌在PSA培养基平板上菌落突起，白色致密呈絮状，菌丝体为有隔菌丝、无色，在培养基上培养4d～5d出现粉红色，小型分生孢子无色、长椭圆形、单胞或偶有一个分隔。大型分生孢子镰刀形、无色、有1个～5个隔膜、多数为3个隔膜。西瓜枯萎病菌菌落形态及分生孢子形态特征见图D.1。菌落正面形态 b)菌落背面形态c)大型分生孢子 d)小型分生孢子图D.1 西瓜枯萎病菌形态附 录 E（资料性）西瓜枯萎病菌DNA的提取DNA提取步骤如下：将待测菌株于285d后，收集菌丝；CTAB将破碎管放于6530min，中间颠倒混匀2次；加入等体积的苯酚/氯仿/（体积比为10min；吸取上清液至1.5mL离心管中，重复步骤d）一次；加入2倍或2.5倍的预冷无水乙醇和1/103MNaAc（pH5.2）（或用0.6倍的预冷异丙醇沉淀），室温沉淀20min，12000rpm/min离心10min；用70%的乙醇洗涤沉淀两次；40L或含RNsNandrop检测DNA的纯度和浓度后，保存于-20附 录 F（资料性）西瓜枯萎病菌PCR检测PCRDNAITS1/ITS4、EF1-728F/EF1-986R、CYLH3F/CYLH3R、ACT-512F/ACT-783RITS、TEF-1、HIS、ACT（F.1）。表F.1真菌鉴定用引物信息扩增基因引物名称引物序列退火温度（℃）参考文献ITSITS15’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’54500-750Whiteetal.，1990ITS45’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’EFEF1-728F5’-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3’52300-450Carbone&Kohn，1999EF1-986R5’-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3’ACTACT-512F5’-ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC-3’56300-450Crousetal.，2004ACT-783R5’-TACGAGTCCTTCTGGCCCAT-3’HISCYLH3F5’-AGGTCCACTGGTGGCAAG-3’54350-400Carbone&Kohn，1999CYLH3R5’-AGCTGGATGTCCTTGGACTG-3’反应体系：基因组DNA（20ng）1μLForardPrier10μmo·）2μLRevrs