DB51T 1843-2014 猪A群轮状簿RT-PCR检测技术规范　

猪A群轮状病毒RT-PCR检测技术规范2014-09-19发布2014-10-01实施四川省质量技术监督局发布I 12规范性引用文件 13术语和定义 14设备和试剂 1 26反转录 37PCR扩增 3 39结果判定 310废弃物无害化处理 3附录A(规范性附录)相关试剂的配制 5本标准的附录A为规范性附录。本标准由四川省农业厅提出并归口。本标准由四川省质量技术监督局批准。本标准起草单位：西南民族大学。本标准主要起草人：任玉鹏、岳华、汤承、张斌、张焕容、杨发龙、王远微。1猪A群轮状病毒RT-PCR检测技术规范本标准规定了猪A群轮状病毒RT-PCR检测方法。本标准适用于猪只感染猪A群轮状病毒的检测、诊断和流行病学调查。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB16548病害动物和病害动物产品生物安全处理规程《兽医实验室生物安全技术管理规范》(2003农业部公告第302号)3术语和定义本标准采用下列术语和定义。猪A群轮状病毒groupAporcinerotavirus,GAR猪轮状病毒(porcinerotavirus,PRV)是呼肠孤病毒科、轮状病毒属成员，基因组由11个节段的双股正链RNA组成；PRV主要包括A、B、E、C四个血清型，临床上猪只感染以猪A群轮状病毒(group猪A群轮状病毒病以猪A群轮状病毒为主要病原，引起剧烈呕吐、腹泻和脱水等为特征的人畜共患胃肠道传染病。4设备和试剂4.1主要仪器和设备4.1.1PCR扩增仪4.1.2电泳仪、水平电泳槽4.1.3凝胶成像系统4.1.4冷冻高速离心机4.1.5微量高速离心机(适合于对PCR反应管进行离心操作)4.1.6高压蒸汽灭菌锅4.1.7涡旋仪24.1.8恒温水浴锅4.1.9移液器(0.1μL～2.5μL、0.1μL~10μL、20μL～200μL、200μL～1000μL)4.2主要试剂4.2.1引物(10μmol/L)P1:5'-TCAAGCACGATTTGP2:5'-GCCTGGTGGAAATACT扩增片段长度274bp。4.2.2变性液：见附录A.1。4.2.32mol/L醋酸钠溶液(pH4.0):见附录A.2。4.2.4水饱和酚(pH4.0)。4.2.5氯仿/异戊醇(49/1)混合溶液。4.2.6PrimescriptTMRT试剂盒4.2.7TaqDNA聚合酶(5U/μL)。4.2.81.0%琼脂糖凝胶：见附录A.3。4.2.950×TAE缓冲液：见附录A.4。4.2.10核酸染料(Goldview)。4.2.11DEPC处理的灭菌双蒸水：见附录A.5。4.2.12异丙醇。4.2.13DEPC处理的灭菌双蒸水配置的75%乙醇：见附录A.6。4.2.1510×PCR缓冲液。4.2.166×上样缓冲液(6×LoadingBuffer)。4.2.17DNA分子量标准DL600。4.2.18水：所用水应符合GB/T6682中三级水(三蒸水)规格。4.2.19阳性对照：猪A群轮状病毒CVCCAV69株购自国家兽医微生物菌种保存中心。4.2.20阴性对照：用符合GB/T6682中的三级水代替RT-PCR扩增模板。5.1样本处理5.1.1肠内容物：选择疑似病症的猪只，无菌采集小肠内容物1g,用10mmol/LPBS缓冲液稀释10倍；在涡旋仪上振荡混匀后反复冻融2次，10000r/min离心10min,取上清液备用。5.1.2肛门拭子：将肛门拭子等棉拭子浸入1mL的10mmol/LPBS缓冲液中30min,充分混匀后反复冻融2次，12000r/min离心10min,取上清液备用。5.1.3腹泻粪便：采集病猪新腹泻粪便1g,用10mmol/LPBS缓冲液将粪便稀释10倍，在涡旋仪上振荡混匀后反复冻融2次，10000r/min离心10min,取上清液备用。5.1.4对照样本：阴阳性样本处理与检测样本处理方法相同。5.2异硫氰酸胍一步法抽提RNA5.2.1每次试验前应设立阳性和阴性对照。35.2.2取处理后待检样品上清液100μL,加入变性液300μL颠倒混匀，加入30μL2mol/L乙并取上清。5.2.3依次加入150μL饱和酚、150μL氯仿-异戊醇，反复颠倒混匀5次，冰浴15min。5.2.412000r/min、4℃离心20min,将上层含RNA的水相移入一新管中，不应吸取水相的最下层。5.2.5加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，冰浴静置10min沉淀RNA。5.2.612000r/min、4℃离心10min,弃上清。5.2.7加入1mL用DEPC水配制的75%乙醇颠倒混匀洗涤沉淀，12000r/min、4℃离心10min,弃上清。5.2.8将含有RNA沉淀的离心管静置干燥沉淀5min~10min,用20μLDEPC处理水将沉淀充分溶解，在-20℃条件下保存备用。6反转录6.1cDNA的合成：将溶解的RNA按照反转录试剂盒说明书反转录合成cDNA。增仪中进行反转录(RT)反应。6.3cDNA的合成条件为：37℃15min,85℃5s,4℃5min。反转录后得到的cDNA置于-20℃保存。7PCR扩增7.1PCR反应体系：10×PCRBuffer2.5μL、MgCl2(25mM)2μL、dNTP(2.5mM)2μL、TaqDNAμL、模板cDNA2μL,总体系25μL。7.2PCR反应条件：94℃预变性5min,94℃30s,51℃30s,72℃30s的循环，进行35个循8PCR产物的电泳检测8.1用TAE电泳缓冲液配制成2%琼脂糖凝胶(见附录A)。8.2取5μLPCR产物与1μL6×上样缓冲液混合，分别加入样品孔，同时在一加样孔中加入DNA分子量标准(DL600),以5V/cm恒压电泳，采用凝胶成像系统判定核酸片段大小。9结果判定9.1阳性对照出现一条274bp大小的条带，且阴性对照样本不出现条带。9.2在满足10.1条件下，被检样品的PCR产物经电泳后出现一条约274bp的条带判定为核酸阳性(+);被检样品的PCR产物经电泳后不出现274bp的条带判定为核酸阴性(-)。10废弃物无害化处理4A.1变性液钠溶293mL水中。65℃搅拌混匀，溶解充分。室温下保存，使用前按每50mL变性液加0.36mL14.4在100mL容量瓶中，加入16.4g乙酸钠，加入适量灭菌双蒸水，用冰乙酸调pH至4.0后定容。用琼脂糖1.0g,1×TAE电泳缓冲液100mL,混匀后在微波炉中完全融化，待冷却至50℃~60℃时，加核酸染料10μL,摇匀倒入凝胶板，待凝固后取下梳齿，备用。在100mL容量瓶中，加入EDTA18.61g,加入适量灭菌双蒸水，用氢氧化钠调pH至8.0时定容。A.4.2TAE电泳缓冲液(50×)