(高清版)DB22∕T 2050-2014 动物源性饲料中猪源性成分测定实时荧光PCR方法

Determinationofporcinederivedmaterialsinanimal-orig2014-02-28发布2014-04-30实施吉林省质量技术监督局发布I本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。本标准主要起草单位：吉林省产品质量监督检验院、国家农业深加工产品质量监督检验中心、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局。本标准主要起草人：史艳宇、刘金华、华蕾、王潇、亓晓艳、王颖、冷喜芳、吴桐、陈颖。1动物源性饲料中猪源性成分测定实时荧光PCR方法1范围件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义5试剂2a)上游引物：5'-CATGCGTATC5.3dNTP:dATP(deoxyadenosinetriphosphate,脱氧腺苷三磷酸)、dGTP(deoxycytidinetriphosphate,脱氧鸟苷三磷酸)、dCTP(deoxycytidinetriphosphate,脱氧胞苷三磷酸)、dTTP(deoxythymidinetriphosphate,脱氧胸苷三磷酸)。5.4动物基因组DNA提取纯化试剂盒。5.5RNaseA酶：冻干品，不含DNase。5.775%乙醇、异丙醇、三氯甲烷、异戊醇、正己烷等有机试剂。5.9三羟甲基氨基甲烷(Tris)。5.11十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrithylammoniumbromide,CTAB)。5.12乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA-Na₂·2H₂O)。5.1310×PCR缓冲液：含200mmol/LTris-HCI(pH8.4),200mmol/L氯化钾(KC1),15mmol/L氯5.16乙酸钠溶液，3mol/L:在8到5.2,用水定容到100mL,分装后高压灭菌。5.17Tris-HCI,1mol/L,pH8.0:在800mL去离子水中溶解121.1gTris,冷却至室温后用浓盐酸调节溶液的pH值至8.0,加水定容至1L,分装后高压灭菌。5.18EDTA,0.5mol/L,pH8.0:称取186.1gEDTA-Na₂·2H₂O,加入700mL水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用10mol/L氢氧化钠调pH值至8.0,用水定容到1L,分装后高压灭菌。5.19CTAB提取缓冲液I:在800mL去离子水中加入46.75g氯化钠，溶解后加入1mol/LTris-HCI(pH8.0)50mL,0.5mol/LEDTA(pH8.0)20mL,在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用10mol/L氢氧化钠调节溶液的pH值至8.0,用水定容至1L,分装后高压灭菌。5.20CTAB提取缓冲液Ⅱ:在800mL去离子水中加入46.75g氯化钠，20gCTAB,完全溶解后加入1mol/LTris-HCl(pH8.0)50mL,0.5mol/LEDTA(pH8.0)20mL,用水定容至1L,分装后高压灭菌。5.23TE缓冲液(pH8.0):在800mL水中，依次加入10mL的1mol/LTris-HCl(pH8.0)和2mL的0.5mol/LEDTA(pH8.0),用水定容到1L,分装后高压灭菌。36.1实时荧光PCR仪。7检测步骤5μL~25μL蛋白酶K溶液，上下倒转混匀，37℃水浴中保温1h,中途每隔10min左右倒转混合数次；和三氯甲烷+异戊醇(24+1)抽提三次，12000r/min离心10min;将上清液转移至干净的2mL离心管液(预先加热至65℃有利于溶解DNA)中，-20℃保存备用。取油脂饲料适量(液态油取30mL、磷Tris饱和苯酚+三氯甲烷(1+1),轻缓颠倒混匀溶液；12000r/min离心10min,取上清液，加入与上清液等体积三氯甲烷+异戊醇(24+1),轻缓颠倒混匀，12000r/min离心2min至分层；将上清液转移至于100μLTE缓冲液(预先加热至65℃有利于溶解DNA)中，-20℃保存备用。7.2.3试剂盒法4…c——DNA浓度，单位为纳克每微升(ng/uL);N——核酸稀释倍数。7.4实时荧光PCR检验7.4.1实时荧光PCR反应体系10×PCR缓冲液dNTP溶液(10mmol/L)TaqDNA聚合酶(5U/μL)上游引物(10μmol/L)DNA模板(10ng/μL-50ng/μL)反应产物可在4℃保存。检测过程中设置PCR扩增空白对照、阴性对照和阳性对照。用已知含有猪8结果判断与表述5——空白对照：无扩增曲线，Ct值≥40.0;——阴性对照：无扩增曲线，Ct值≥40.0;——阳性对照：出现典型的扩增曲线，Ct值应≤35.0;否则，视为无效。8.2结果判定和报告：——Ct值≥40.0,可判定样品不含有猪源性成分，可直接报告未检出猪源性成分。——Ct值≤35.0,可判定该样品含有猪源性成分，报告检出猪源性成分。