《化妆品眼刺激性-鸡胚绒毛尿囊膜血管试验》

ICS71.100.70

CCSY42

GDCA

广东省化妆品学会团体标准

T/GDCA010—2022

化妆品眼刺激性-鸡胚绒毛尿囊膜血管试验

Cosmeticseyeirritation-ChorioallantoicMembraneVascularAssay

（征求意见稿）

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XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施

广东省化妆品学会  发布

T/GDCA010—2022

化妆品眼刺激性-鸡胚绒毛尿囊膜血管试验

1范围

本文件规定了鸡胚绒毛尿囊膜血管试验的基本原理、试验准备、试验方法、评判标准及结果分析。

本文件适用于化妆品、化妆品原料刺激性的评估。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T17999.1SPF鸡微生物学监测第1部分：SPF鸡微生物学监测总则

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

眼刺激性eyeirritation

眼前部直接接触受试物后引起的眼及其周围粘膜可逆性炎性变化。

绒毛尿囊膜chorioallantoicmembrane,CAM

胚龄4d～5d时，由绒毛膜体壁中胚层和尿囊膜脏层中胚层融合而成，其组织学结构有三层。

鬼影血管ghostvessel

血管内无血液灌注的血管现象。

充血hypermia

血管内血液不流动或血液充盈所致的血管膨胀现象。

出血Hemorrhage

血液从血管内流出血管外，可以表现为血管外出现点状出血或絮状的弥漫性出血等多种形式。

无特定病原体SpecificpathogenFree,SPF

一般指无传染病、无特定的微生物和寄生虫存在。

4基本原理

绒毛尿囊膜（CAM）上丰富的血管网络很好地模拟了眼结膜结构，因此，基于CAM的体外测试是眼刺

激使用最早和最广泛的替代方法之一。本试验利用孵化第10天胚龄受精鸡胚绒毛尿囊膜血管系统完整、

明显和透明的特点，将一定量受试物直接与绒毛尿囊膜接触，作用一段时间之后观察绒毛尿囊膜血管损

伤（如鬼影血管、毛细血管充血、不同程度的出血），对不同的血管损伤程度进行评分，血管损伤越严

重分值越大，刺激性越严重。本试验特别强调CAM的血管效应，如由此引发的鬼影血管、毛细血管充血、

不同程度的出血等现象。

5试验准备

1

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鸡胚

5.1.1品系和来源

应当选用SPF鸡胚，推荐选用白莱杭鸡（WhiteLeghornchicken）受精鸡胚，也可选用其它品系鸡

胚，供应商应具有农业部门认可的《兽药生产、检验用SPF鸡(蛋)定点生产企业》资格，鸡胚质量应符

合相关标准的要求，如GB/T17999.1。

5.1.2运输和贮存

购买7天胚龄以内的鸡胚，应在不影响胚胎活性或发育的情况下转移或运输鸡胚，尽量避免对鸡胚

摇动、不必要的倾斜、敲打以及其它机械性刺激。

未放置于孵化箱培养0天胚龄的鸡胚宜置于13℃-22℃条件中存放，为减少贮存时间对种蛋质量的影

响，一般不宜超过7天。

5.1.3孵化条件

孵化温度37.5℃±0.5℃，相对湿度55%-70%，转盘频率1次/小时-6次/小时。0天胚龄的鸡胚孵化前

应使用含有浓度为0.1%苯扎溴铵溶液或其它不影响鸡胚生长发育的消毒剂进行清洁并消毒表面。

5.1.4试验鸡胚挑选

试验前，将待检测鸡胚取出，置于黑暗处，用照蛋器检查胚胎情况，若有丰富、规律的血管，则鸡

胚存活，若血管稀少且无一定规律或无血管生长，则鸡胚没有孵化成活或没有受精，弃之。

设备仪器和试剂

5.2.1试验所需仪器设备如下：

——恒温恒湿培养箱；

——自动孵化箱；

——LED高亮度冷光源照蛋器；

——解剖器具：医用锯齿镊刀或尖头镊；

——聚四氟乙烯树脂环：12*9*1.5mm；

——移液枪及一次性适配吸头；

——电子计时器；

——玻璃器皿：锥形瓶、小烧杯；

——保鲜膜；

——小喷壶。

5.2.2试验所需试剂如下：

本文件所用试剂和水，除非另有规定，应使用分析纯试剂和应符合GB/T6682-三级水的规定。

——氯化钠；

——丙烯酰胺；

——无菌水。

受试物及制备

5.3.1原料

应根据常用添加量或建议添加量选一个或多个浓度用溶剂制备成澄清的溶液。水溶性原料可采用无

菌水作为溶剂，油溶性原料可采用橄榄油或其它不引起血管损伤的物质作为溶剂。

5.3.2化妆品成品或半成品

化妆品半成品及成品应以原液未稀释的形式进行测试；面膜成品应将料体挤至无菌的锥形瓶中再进

行测试。

对照物及制备

5.4.1阴性对照

2

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通常选用质量浓度为0.9％的氯化钠溶液，用于阴性对照。每次受试物测试，均应设置0.9％氯化钠

溶液的阴性对照，确保试验条件不会导致刺激性反应出现。

5.4.2阳性对照

每次试验都应设立一个阳性对照，如果检测试验只是用于鉴定严重刺激性物质，则阳性对照物应当

是一种在CAMVA中能产生严重反应的物质，如10%丙烯酰胺。一般来说，10%丙烯酰胺通常表现为中度刺

激性。亦可选用其他具有中度刺激性物质作为阳性对照。

5.4.3溶剂对照

如果受试物用橄榄油进行稀释，那么试验应设置橄榄油为溶剂对照。如果使用除无菌水或橄榄油以

外的其他溶剂或载体，则选择这种溶剂或载体作为对照物质。

预试验

5.5.1预试验目的及必要性

确定受试物是否适合用本方法试验，确定受试物的血管情况是否能够用该评价方法进行评价。（可

参考表1）。

5.5.2预试验条件

需要对受试样品进行预试验，一般针对颜色较为特殊或可能具有染色功能的原料、半成品及成品或

受试样品的状态为粉状等特殊样品需要进行预试验。

5.5.3预试验过程

预试验用3枚鸡胚，取约40µL（µg）受试物均匀覆盖在受试环内的CAM表面，受试物作用30分钟后，

观察血管反应情况，记录观察结果。

5.5.4受试物局限性

如果预试验结果表明血管损伤情况不属于标准评价（见表1）范围内及受试物的物理特性，既不能

用液体添加法（见6.3）也不能用固体添加法（见6.4）进行试验，则正式试验不必进行。

这些情况包括：

——血管效应不属于标准评价范围；

——对血管具有药理作用的血管活性物质；

——对CAM具有不可逆染色作用的染料；

——对CAM具有粘附作用且不可冲冼的粘性物质。

6试验方法

试验分组

每个受试样品应采用10枚鸡胚进行测试，每批次鸡胚应设阴性对照、阳性对照，各不小于3枚，必

要时应设立溶剂对照。

CAM制备

取出一个10天胚龄的鸡胚，用照蛋器照看气室，确定气室位置，用手捻钻手动打孔工具在气室上开

一个小窗口，用医用眼科弯尖头镊子剥去气室上层的蛋壳部分，暴露白色的卵壳膜，吸管滴加适量0.9%

氯化钠溶液使卵壳膜湿润，待完全湿润后将0.9%氯化钠溶液倾出。小心用镊子去除卵壳膜，去除过程中

要谨慎，保证血管膜不受损，去除卵壳膜后露出丰富毛细血管的则是CAM。

液体添加法

6.3.1添加受试样

3

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将聚四氟乙烯树脂环置于CAM上，作为受试区域，用移液枪移取40μL的待测样品至聚四氟乙烯树脂

环内，记录加样品的时间,用无菌水打湿保鲜膜后并将打湿面的保鲜膜盖在气室上，把鸡胚移至恒温恒

湿箱内培养30分钟。

6.3.2结果观察

取出受试鸡胚，根据血管损伤程度评分（标准可参考表1）。必要时可设备对反应前后的绒毛尿囊

膜情况进行拍照记录，并通过过反应前后的照片比对，对CAM的损伤情况及程度进行分析。

固体添加法

6.4.1添加受试物

将聚四氟乙烯树脂环置于鸡胚的绒毛尿囊膜上，作为受试区域，用药勺或活塞式移液器取适量的待

测样品约40μg，即均匀铺平至聚四氟乙烯树脂环内。记录加样时间用无菌水打湿保鲜膜后并将打湿面的

保鲜膜盖在气室上，把鸡胚移至恒温恒湿箱内培养30分钟。

6.4.2结果观察

取出受试鸡胚，根据血管损伤程度评分。若受试物影响结果的观察，则在观察前需用0.9%生理盐水

轻轻冲洗受试区域内待测物质，直至可清晰观察到CAM的情况为止，冲洗次数尽可能保持在3次以内。取

出鸡胚后应立即观察环内的血管损伤情况并进行评分（标准可参考表1）。必要时可用设备对反应前后

的CAM情况进行拍照记录，并通过反应前后的照片比对，对CAM的损伤情况及程度进行分析及评价。

表1评分标准

血管效应评分现象描述

无反应0观察不到反应，CAM正常。

鬼影血管1血管内无血流，血管清晰。

毛细血管损伤2充血，即CAM毛细血管或小血管的管血流增加。

极轻微出血3环内有细小出血点（1-10个）。

轻微出血4环内有细小出血点＞10个或小出血点不可数且覆盖环内区域不足1/8。

极轻度出血5环内出血点覆盖面积1/8－1/4。

轻度出血6环内出血点覆盖面积1/4－1/2。

中度出血7环内大量出血点或小区域出血范围达到1/2－3/4。

严重出血8环内出血点区域＞3/4。

7结果分析

每枚鸡蛋的结果应进行评价及记分，最终将得出的10个分值去除最高分和最低分，剩余8个有效分

值，根据应用式（1）计算刺激分（Normalconcentrationirritationscore，NC）。

····················································(1)

�1+�2+…+��

式中：𝑁=�

X——刺激评分；

n——去除最高分和最低分后有效鸡胚个数。

根据计算的NC数值按表2受试物刺激性进行分类。

4

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表2刺激性评价

分值表现备注

0<NC≦2无刺激无损伤性刺激，此时毛细血管未有出血损伤。

2<NC≦3轻微刺激轻微损伤性刺激，此时毛细血管出现轻微性出血损伤。

3<NC≦5中度刺激较为严重的损伤性刺激，此时毛细血管出现较为严重的出血损伤。

NC＞5严重刺激极为严重的损伤性刺激，此时毛细血管大面积出血，且出血量较大。

8废弃物处置

试验用鸡胚应用高浓度消毒剂消毒处置后，按一般的废弃物进行处理。具有刺激性、丙烯酰胺等废

液按危险废物处理。

9检测结果报告

试验报告应包含以下内容：

——受试物信息：名称、批次、样品性状及特性；

——受试物测试鸡胚个数、有效鸡胚个数、分值及结果评价。

5

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A

A

附录A

（资料性）

测试结果中血管效应

测试结果中血管效应代表性图见表A.1。

表A.1测试结果中血管效应代表性图

无反应鬼影血管

毛细血管损伤极轻微出血

轻微出血极轻度出血

轻度出血中度出血

6

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严重出血