《虎耳草多酚的抗氧化能力实证研究》14000字（论文）

虎耳草多酚的抗氧化能力实证研究摘要虎耳草多酚类物质含量丰富，生长地区广泛，易于栽培，具有极高的药用与食用价值。用虎耳草为原料，经过闪氏提取器打碎后，使用乙醇溶液为溶剂进行虎耳草多酚物质的提取，提取产物经过大孔吸附树脂进行纯化后进行高效液相色谱分析。通过实验可知虎耳草的闪氏提取最优方案为料液比1:30、体积分数40%、提取电压80V、提取时间90s，在此实验条件下多酚提取率为2.50%。多酚抗氧化性实验表明虎耳草多酚具有良好的抗氧化能力且抗氧化能力在一定浓度范围内有线性关系，虎耳草多酚对超氧自由基具有良好的清除效果，对羟基自由基的清除能力略差，对DPPH清除率最低。关键词虎耳草；多酚提取；纯化；抗氧化性=目录摘要 I1绪论 11.1虎耳草概述 11.2虎耳草功效 11.2.1强心作用 11.2.2利尿作用 11.3植物多酚概述 11.3.1植物多酚种类 2类黄酮类 2酚酸类 2木酚素 2单宁酸 2姜黄素 21.3.2多酚类物质生理功能 3抗癌作用 3消炎、抑制细菌的作用 3降低血脂的作用 31.4提取方法 31.4.1溶剂提取法 31.4.2微波辅助提取 41.4.3离子沉淀法 41.4.4超临界流体萃取 41.4.5生物酶解提取 41.4.6闪氏提取法 51.5多酚的检测方法 51.5.1紫外-可见分光光度法 51.5.2高效液相色谱法 51.6虎耳草多酚的抗氧化性测定 51.6.1清除ABTS自由基法[32] 51.6.2对DPPH的清除能力 61.6.3羟基自由基的清除能力 61.6.4超氧自由基清除实验 61.7研究意义 62材料及方法 72.1设备及所用试剂 72.1.1主要仪器设备 72.1.2试剂 72.1.3材料 72.2多酚标准曲线的绘制 82.3虎耳草多酚物质的闪氏提取过程 82.3.1虎耳草闪氏提取的单因素实验 8闪氏提取所用乙醇溶液体积分数的确定 8提取料液比的确定 8提取电压的选择 9提取时间的选择 92.3.2提取率公式 92.4大孔吸附树脂对虎耳草多酚类物质的纯化 92.4.1大孔吸附树脂的预处理方法 92.4.2大孔吸附树脂上柱 102.5高效液相色谱分析 102.5.1HPLC实验准备 102.5.2HPLC操作流程 102.6虎耳草多酚抗氧化性分析 102.6.1测定虎耳草多酚对DPPH自由基清除率 102.6.2测定虎耳草多酚对羟基自由基清除率 112.6.3测定虎耳草多酚对超氧自由基清除率 113结果及分析 123.1多酚标准曲线的测定 123.2闪氏提取法提取虎耳草多酚 123.2.1最佳乙醇体积分数的选择 123.2.2最佳料液比的选择 133.2.3最佳提取电压的选择 143.2.3最佳提取时间的选择 143.3闪氏提取的正交试验 153.6样品的高效液相结果 163.7虎耳草多酚的抗氧化性测定 173.7.1对DPPH自由基的清除结果 173.7.2对羟基自由基的清除结果 183.7.3对超氧自由基的清除结果 183.7.4对ABTS自由基的清除结果 19结论 20致谢 21参考文献 221绪论1.1虎耳草概述虎耳草（SaxifragastoloniferaCurt）也被称为金丝荷叶，耳朵红，为\o"虎耳草科"虎耳草科\o"虎耳草属"虎耳草属下的一个种，分布于中国、朝鲜和日本。绿色草本植物，整株植物上生有细毛。紫红色细长的根茎，繁殖方式为枝茎着地即可产生新的植株。叶片形状为椭圆形或不规则圆形，丛生于茎基部，叶片边缘生有不规则的锯齿，两面颜色分别为绿色和紫红色。6～7月开花，花梗自叶丛中抽出，着生红紫色长毛，有五片白色的花瓣，其果实的形状为卵圆形。始载于我国南宋医药学家王介著的《履巉岩本草》。具有清热解毒、消炎镇痛、去除湿热的作用。在我国民间大多用于治疗风疹湿疹、感染性中耳炎、外皮擦伤、肺热咳喘、肺痈、疖肿慢性支气管炎等疾病[1]我国中草药资源丰富，分布广泛产小五台山（位于河北省）、陕西、甘肃、江苏、及浙江等地。此外，将中草药当做饲料添和加剂应用于畜牧养殖行业的时侯还具有促进动物成长、提高动物机体的免疫力、减缓应激反应、改善动物制品的品质等优点[2]虎耳草的枝叶中含岩白菜素，槲皮素，没食子酸，原儿茶酸和甲基延胡索酸。茎含儿茶酚。而且从虎耳草中还可以提取到熊果酚甙，槲皮素-5-O-葡萄糖甙，氨基酸，硝酸钾及氯化钾等物质。其内部所含的酚酶能把咖啡酸氧化成相应的邻位醌，发生自然氧化而生成马栗树皮素，使虎耳草在医学上具有很高的研究价值。1.2虎耳草功效1.2.1强心作用取虎耳草新鲜汁液或其乙醇提取液作用于离体蛙心，实验结果表明两种溶液都对蛙心有一定的强心作用。若将溶液中钙离子出去后，实验结果表明仍然对离体蛙心产生强心作用，只是效果不如去钙离子之前。1.2.2利尿作用使用虎耳草乙醇提取液对犬类和兔类动物进行活体静脉注射，实验结果表明虎耳草乙醇溶液具有一定利尿作用，若将虎耳草提取液中的甙类物质破坏或除去之后，结果仍然显示一定的利尿作用。1.3虎耳草提取物的研究进展1.3.1虎耳草素的生理功能研究根据雷瑾[3]等人对相关文献的查阅整理发现虎耳草素具有良好的止痛和护肝作用，并且对一些炎症特别是HIV病毒存在抑制作用，其中异虎耳草在治疗咳嗽方面功效显著，通过动物实验证明一定剂量的虎耳草素能使动物的免疫力获得一定程度的增强，同时虎耳草素对农作物上常见病菌具有较强的抑制作用，在抑制农害方面应用前景较为广阔。1.3.2虎耳草精油的研究进展张之侠[4]以虎耳草为原料，对其中的虎耳草精油进行提取并对其成分和抑菌活性进行分析得出结论虎耳草精油中所含的化学成分大部分为十五烷酸还有极少数烃类醇类等物质。抑菌活性的实验表明虎耳草精油对小麦病毒具有极强的抗菌作用并且对其他病菌的抑菌效果良好，但是虎耳草精油中的具体抑菌成分尚不明确，需要进一步实验来证明和验证。1.3植物多酚概述植物多酚(plantpolyphenol)是一类广泛存在于各种植物的皮、根、叶、果中的具有酚类组成结构的次级代谢产物。一般认为植物多酚是相对分子质量在500-3000之间的单宁或鞣质,还可以是以花青素、栎精、没食子酸熊果嘧啶为代表的相对分子上质量较小的酚类化合物。通常认为植物多酚分为2类:水解单宁和缩合单宁。水解单宁在结构组成上和缩合单宁有较大差异,导致两种物质的化学性质和反应机理也不相同，例如水解南宁的酸碱稳定性较差易发生水解，而缩合单宁的酸碱稳定性略强，在pH较高的条件下生成沉淀。但是两种物质所共有的多酚结构使它们在一些化合反应上具有共同特性。1.3.1植物多酚种类植物多酚物质种类繁多，分布广泛，在蔬菜和水果等植物中含量较高，并呈现出不同的颜色，主要以共轭形式出现，通常作为营养强化剂添加在保健食品中，具有多种保健作用，目前发现的多酚类物质已经有8000多种[5]类黄酮类黄酮类化合物广泛存在与植物和水果中，进一步分类有黄酮醇、花色素等[6]，功效众多具有良好的抗氧化作用，对人体健康起到保健作用，如降低胆固醇阻止肥胖的发生[7-8]且在动物饲料中也有应用，在动物饲料中添加黄酮类化合物可减少动物的发病率，使动物肉制品的口感肉和品质得到提高[9]。酚酸类一种非类黄酮物质在植物中通常以游离态和结合态两种形式存其衍生物大多属于苯甲酸和肉桂酸类[10]具有良好的杀菌和清除自由基作用可用于化妆品中具有使肌肤美白的功效。木酚素木酚素是一种的植物雌激素，多以二聚体形式存在，在亚麻籽中的含量较多。在治疗血管疾病和抑制癌细胞方面功效显著对更年期症状有一定的缓解作用具有抗氧化、降低血糖、抗肿瘤等功效[11]。单宁酸单宁是属于植物多酚中的一种天然化合物，以水解单宁和缩合单宁两种形式存在于植物中具有良好的抑菌消炎，清除人和动物体内自由基的作用[12]也可用于动物饲料中的食品添加剂提高动物制品的品质和口感。姜黄素姜黄素是一种多酚类化合物，通常来源于姜科植物的根茎中，化学式为C21H20O6。能够维护体细胞组织，能防衰老，抗抑郁，对脂肪组织也是有缓冲作用，对减肥有一定的好处医学研究证明，姜黄素具有良好的消炎抑菌，对癌细胞有一定的抑制效果并且能够提高人体免疫力维护人体健康的优良生理作用[13]。1.3.2多酚类物质生理功能抗癌作用医学研究表明水果和蔬菜中的多酚类物质具有阻止癌细胞和肿瘤生长的作用，能够抑制多种癌细胞的生长和繁殖且具有良好的抗氧化性，改善细胞周期，促进癌细胞凋零对正常细胞有一定的保护能力。左丽丽[14]等人以东北野生猕猴桃为原料研究猕猴桃多酚的抗癌活性实验表明，猕猴桃中含有的多酚物质具有良好的抗癌活性，但是抗癌机理目前尚不明确。消炎、抑制细菌的作用有实验结果显示多酚类的物质可以有效抑制大肠杆菌[15]、铜绿荧光假单孢芽胞菌、金黄色荧光葡萄球菌等多种致病菌的生长。刘晓艳等研究者对荷叶葡萄中的黄酮进行了提取,并对其进行了抑菌优化试验,发现其中的物质可以有效抑制土壤中的铜绿假荧光单孢菌、酵母菌、荧光假单孢菌等的生长,并通过优化的抑菌实验得到了黄酮抑菌的最低作用浓度。李凤英[16]等研究者利用荷叶葡萄中提取的多酚类黄酮物质对荷叶枯草中的铜绿芽孢杆菌、伤寒沙门氏菌、普通变形杆菌等进行了多种抑菌优化实验,实验结果表明,葡萄球菌中所含有的的多酚黄酮类物质对以上的大肠杆菌，沙门氏菌等细菌都具有一定的杀菌作用。降低血脂的作用随着小康社会的全面建成，人们的生活条件越来越好，日常饮食习惯也在逐渐改变，导致高血脂患者日益增多，逐渐成为现代社会危害健康的主要疾病之一，而多酚类物质具有明显改善高血脂，预防血管疾病的作用而越来越受到人们的重视。熊何建[17]等人的实验结果表明葡萄籽多酚具有抑制血脂升高，促进脂质分解的作用，说明多酚类物质具有良好的降脂作用，并且对肝脏有一定的保护作用。1.3.3多酚的研究进展多酚对肠道菌群的影响研究根据任彩君，吴黎明[18]等人研究多酚物质对人体肠道菌群作用的研究结果表明，膳食多酚对人体肠道健康的作用巨大，主要表现在影响肠道内的菌类组成和改善肠道内各种生物酶的活性，调节肠道菌群失调，维持肠道内环境稳态免受有害细菌的破坏，同时又能起到预防糖尿病和心血管疾病，增强人体免疫力，为多酚在调节人体内环境和预防多种疾病方面提供了新的参考方向。多酚在水产品保鲜方面的研究进展蓝蔚青[19]等人以茶多酚研究对象探究茶多酚对水产品保鲜的功能，发现茶多酚能够有效抑制水产品蛋白质的氧化阻止鱼肉发生腐败变质并延长保存时间。尤其甲酯化处理后的改性茶多酚不仅具有良好的抗氧化性，而且其脂溶效果也得到了巨大提升，茶多酚作为保鲜剂与传统的化学保鲜剂相比具有天然无毒、使用安全、制备成本低、保鲜效果好等明显优势，使茶多酚在水产品保鲜领域有巨大潜力。1.4提取方法植物多酚的提取方法繁多，现在普遍使用的多酚提取方法有:超临界流体萃取法；生物酶解法；微波辅助提取；离子沉淀法提取。提取所用的溶剂通常以丙酮-水反应体系为主[20-24],还有的使用甲醇和甲醇-水的有机混合物为溶剂进行多酚提取[25-27],乙酸乙酯可以用来溶解一些水解单宁和缩合单宁，小分子多元酚类物质可以用硫酸进行溶解。1.4.1溶剂提取法溶剂提取法是根据相似相溶的原理，将所要提取的物质从物料中选择性分离出来并且溶解于其他溶剂中的方法，如果所提取的物质为脂溶性，则选取亲脂性溶剂进行提取，如石油醚、乙醚等，若物质为水溶性，则选取亲水性溶剂进行提取，如乙醇、丙酮等。溶剂提取法提取的效果容易受物料的颗粒大小，提取温度，提取时间等因素的影响，如一些物质在高温下易分解，则温度控制会显著影响实验提取的效果。使用部分有机溶剂进行提取过程中，溶剂会造成污染，对健康产生影响，在后期提纯过程中易存在溶剂分离不完全的情况，引发食品安全问题1.4.2微波辅助提取微波射线可以完全自由地通过对于微波透明的溶剂,从而直接到于植物原料的内部,使得细胞内的温度急剧上涨和增加,较高的温度使原料的细胞壁内压力不断增大而导致细胞发生破裂，从而使所要提取的化学物质溶解于溶剂中。由于不同化学物质的理化性质不同，其对微波射线的吸收和反射能力，产热和放热能力也不尽相同，而使被提取的物质从多种物质混合的体系中分离出来，溶解于对微波吸收能力较差的溶剂中。微波辅助提取[28]不但效率高、它还具有选择性高、能源消耗低、运营成本低、符合环境质量要求等特点,被广泛应用在化学成分主要包括生物碱、黄酮类、有机酸、皂苷、皂甙、皂素类、多糖类的分离与纯化。1.4.3离子沉淀法多酚类物质可以在液体中与某些金属离子发生络合反应生成沉淀而将多酚从原料中分离出来，然后经特定溶剂进行溶解萃取可得到多酚物质。使用该方法进行多酚的提取得到的产品品质较好但是多酚的提取率较低，提取过程中损失较大易造成多酚的氧化而使产率将低，并且提取所用的沉淀剂可能对人体健康有一定的影响，实验整体成本较高，并不是一种满意的多酚类物质提取方法1.4.4超临界流体萃取超临界萃取法就是将超临界的液体作为主要溶剂进行萃取。超临界的液体主要指温度和压力都比临界值大的一种液体,超临界流体主要兼具气体和液体两种化学特征的优点具有良好的溶解性和传质稳定性，且表面张力值为零，它可以与提取物迅速地达到传质均匀,将物质进行有效地分离。通过超临界流体与物料充分接触，由于物料中不同物质的理化性质不同而选择性的溶解物料中需要被提取的物质，通过旋转蒸发而将超临界流体与被提取的物质分离从而达到分离纯化的目的，将萃取分离两种工艺融合为一体。1.4.5生物酶解提取生物酶解技术的原理是利用酶促反应的专一性选择合适的酶类物质对原料的细胞结构进行分解和破坏，从而使所提取的多酚从原料中释放出来并溶解在特定的溶剂中而达到多酚提取的目的。该方法提取多酚的作用条件较为温和，采用非有机溶剂，得到的产品纯度更高且无毒无污染，可以用作少量多酚的提取方法。刘海军等人采用生物酶解技术以低档绿茶为原料使用特定酶类进行茶多酚的提取实验[29]，得出茶多酚的最佳提取条件为酶用量为0.20%、提取温度为60°C、提取时间为80min、pH值为4.6时茶多酚的提取率高达13%1.4.6闪氏提取法组织破碎提取法又称闪式提取法，利用刀头的高速旋转在较短时间内将植物的根、茎、叶、花、果材料研磨成细小颗粒，使细胞内有效成分充分释放，快速溶解于溶剂中，通过过滤达到提取目的。闪氏提取不会对植物内部活性成分造成破坏和分解，提取时间短，工作效率高，且操作方法简单方便，能够节约大量成本，适合多种化学成分的提取分离，是提取虎耳草多酚物质的绝佳方法。组织破碎提取技术适用于植物的各个部位有效成分的提取，在黄酮类、皂苷类、单宁类、多酚类等成分的提取有广泛的应用，可以单品种提取，也可以从多种混合品种中提取。张云等人[30]采用闪氏提取法提取枇杷叶总多酚。结果表明，在相同条件下，闪速提取比回流提取和超声提取的提取率高。1.5多酚的检测方法1.5.1紫外-可见分光光度法紫外-可见分光光度法可以测量物料在190nm到800nm波长范围内的吸光度，如果所检测物质对光不存在吸收作用，可以通过添加特定显色剂的方法使之产生颜色，而对光产生吸收作用。根据朗博比尔定律而对物料进行定性和定量分析适合用作多酚物质的检测。1.5.2高效液相色谱法高效液相色谱法通常用来检测混合物中各组分的存在以及含量，用高压将待测液体注入色谱柱，混合液体中各种成分在流动相与固定相的分配系数不同导致每种成分的运动速度不同而分别从色谱柱内流出。根据流出的先后顺序不同将各组分区分开来并经检测区接收转化为电信号由记录器和电脑转化为图谱。高效液相色谱技术广泛应用于食品和生物等研究如食品中化学添加剂的检测等[31-33]。1.6虎耳草多酚的抗氧化性测定1.6.1清除ABTS自由基法[34] ABTS中文名称为2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐，ABTS自由基清除的实验原理为2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐与过硫酸钾反应生成绿色ABTS。通过检测740nm下原料与ABTS溶液反应后的吸光度与反应前ABTS溶液的吸光度进行对比，如果在740nm吸光度下降则说明原料对ABTS自由基有一定的清除作用，该方法可以用来测定实验所用物质对ABTS自由基的清除能力，并且能与VC作对照来得出其抗氧化能力的大小，目前该方法已被广泛使用1.6.2对DPPH的清除能力DPPH中文名1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，可通过实验原料对DPPH自由基的清除能力来检测物质的抗氧化活性。实验原理为DPPH与清除剂反应后在517nm处的吸光值会比DPPH在517nm处的吸光值有所减小，说明DPPH自由基有一部分被清除而导致吸光值减小从而判断清除剂是否具有抗氧化能力，同时可以用相同浓度VC溶液作对照来评价该清除剂对DPPH自由基的清除能力及抗氧化性，若清除剂的抗氧化性强于VC说明该清除剂具有相当强的抗氧化性。1.6.3羟基自由基的清除能力过氧化氢与硫酸亚铁溶液中亚铁离子生成羟自由基，羟自由基又能与水杨酸生成紫色化合物，通过测定该化合物在510nm处的吸光值可以反映出羟自由基的量，通过该方法比较加入清除剂前后的510nm处吸光值来体现清除剂对羟自由基的清除能力，若加入清除剂后在510nm处的吸光值比加入清除剂要低则能够说明该清除剂对羟自由基具有清除能力。同时可用VC作对照来评价该清除剂的抗氧化能力。1.6.4超氧自由基清除实验本实验采用邻苯三酚法测定清除剂对超氧自由基的清除能力，邻苯三酚可以在碱性条件下自身发生氧化生成超氧自由基，通过比较碱性环境中邻苯三酚与清除剂反应前后所生成的超氧自由基的量，评价清除剂对超氧自由基生成的抑制能力，从而判断清除剂对超氧自由基是否具有清除作用。超氧自由基在320nm具有吸收峰可通过测量反应前后吸光度确定超氧自由基的量，该方法简单易行被广泛运用。1.7研究意义随着人们生活水平的不断提高和社会的之间发展。人们对植物多酚的保健作用越来越重视，虎耳草活性成分中多酚类物质含量丰富，对人体健康有极大益处，但是目前医学上对虎耳草的成分研究技术并不成熟，活性物质不能充分提取和利用，所，可以从提取方法、纯化方法、检验方法、保存方法等方面对虎耳草中多酚类物质进行理化性质分析和分离纯化从而使有效成分得到充分利用。我国虎耳草种植地区分布广泛，物产资源丰富，有利于对虎耳草活性物质进行深度研究和开发利用。

2材料及方法2.1设备及所用试剂2.1.1主要仪器设备KQ-300B型超声波清洗机苏州超声仪器有限公司EL204电子天平梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司HH-4数显恒温水浴锅国华电器有限公司101型电热鼓风干燥箱光正医疗仪器厂ZHBE-50T闪式提取器麦科仪科技有限公司R206B旋转蒸发仪申生科技公司 SHZ-D(III)循环水式真空泵上海东玺制冷仪器设备有限公司双功能数显恒温振荡器上海梅香仪器有限公司TU-1810PC紫外分光光度计欣茂仪器有限公司Agilent1100高效液相色谱仪美国安捷伦科技有限公司2.1.2试剂无水乙醇分析醇国药集团化学试剂有限公司福林酚源叶生物公司焦性没食子酸天津基准化学试剂有限公司无水碳酸钠天津福晨化学试剂厂氢氧化钠江苏徐州腾狮化工厂盐酸上海凌峰化学试剂有限公司Tris水杨酸Feso4过氧化氢DPPH抗坏血酸2.1.3材料X-5型大孔吸附树脂虎耳草将新鲜虎耳草叶在烘箱中进行烘干处理然后放入粉碎机中进行粉碎，将打碎的虎耳草过90目筛，取过筛后的虎耳草粉末加入一定体积分数乙醇后用保鲜膜包裹防止污染和提取时液体飞溅造成损失然后进行闪式提取，将提取液用离心机在4000转离心10min，在760nm波长处测定其吸光值，根据多酚标准曲线计算出样品中多酚物质的准确含量；将闪氏提取后的粗多酚溶液用X-5型大孔吸附树脂纯化，分三次收集纯化后滤液备用。将纯化后的虎耳草多酚提取滤液进行高效液相色谱分析，与多酚标准品对照判断样品中所含多酚类物质的种类及含量。2.2多酚标准曲线的绘制用电子天平准确称取5mg没食子酸粉用少量纯水将其完全溶解、定容至100mL容量瓶，取6只25mL容量瓶进行标号，按标号分别加入0mL、0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL溶液加入1mL福林酚试剂，浓度15%碳酸钠溶液1.5mL加入蒸馏水定容，在避光触反应1h于760nm处通过紫外分光光度计检测吸光值，根据吸光值和浓度绘制多酚的标准曲线。2.3虎耳草多酚物质的闪氏提取过程在烧杯中准确称取一定质量的虎耳草粉末，加入一定量适当浓度的酒精溶液充分浸提，适当搅拌后用保鲜膜将烧杯口进行包裹防止闪氏提取过程中液体飞溅造成物料损失。将闪氏提取器刀头浸入液体但不触碰烧杯底部，闪氏提取器的工作时间控制在40s到160s，工作电压低于150v，避免闪氏提取器长时间高电压工作的情况下机器过热而使设备受损坏。提取完成后，将刀头上升并进行清洗。闪氏提取所得到虎耳草多酚的粗提取液用离心机在4000转进行离心10min后循环水式真空泵抽滤后得到虎耳草多酚物质提取液样品备用。2.3.1虎耳草闪氏提取的单因素实验为得出虎耳草多酚物质提取的最优提取方案，本实验通过控制乙醇溶液的体积分数、料液比、闪氏提取时间和闪氏提取电压进行多组单因素试验，分别计算出固形物的提取率和多酚物质的提取率来确定最优的多酚物质提取方案。闪氏提取所用乙醇溶液体积分数的确定分别量取150mL30%、40%、50%、60%、70%体积分数的乙醇溶液各加入5g虎耳草样品，搅拌后经保鲜膜密封后闪氏提取，将闪氏提取后粗多酚液经离心机离心后用进行抽滤，取少量样液在760nm处用紫外分光光度计测出吸光值，分别计算出不同体积分数的乙醇溶液条件下的多酚提取率以及固形物提取率得出最优结论。提取料液比的确定分别配制体积为75mL、100mL、125mL、150mL、200mL乙醇溶液，体积分数为乙醇体积分数单因素试验得出的最优结果，各加入5g虎耳草样品，搅拌后经保鲜膜密封后闪氏提取，将闪氏提取后粗多酚液经离心机离心后用进行抽滤，取少量样液在760nm处用紫外分光光度计测出吸光值，分别计算出不同料液比乙醇溶液条件下的多酚提取率以及固形物提取率得出最优结论。提取电压的选择将闪氏提取器的工作电压分别设置在40V、60V、80V、90V的条件下进行虎耳草多酚物质的闪氏提取，料液比为料液比单因素试验得出的最优结果，各加入5g虎耳草样品，搅拌后经保鲜膜密封后闪氏提取，将闪氏提取后粗多酚液经离心机离心后用进行抽滤，取少量样液在760nm处用紫外分光光度计测出吸光值，分别计算出不同的闪氏提取器工作电压条件下的多酚提取率以及固形物提取率得出最优结论。提取时间的选择分别将闪氏提取器工作时间设定为30s、45s、60s、75s、90s、闪氏提取器的工作电压为提取电压单因素试验得出的最优结果各加入5g虎耳草样品，搅拌后经保鲜膜密封后闪氏提取，将闪氏提取后粗多酚液经离心机离心后用进行抽滤，取少量样液在760nm处用紫外分光光度计测出吸光值，分别计算出不同的闪氏提取器工作时间条件下的多酚提取率以及固形物提取率得出最优结论。2.3.2提取率公式（1）固形物提取率其中：m1——固形物质量+培养皿质量，g；m0——培养皿质量，g；v1——粗多酚抽滤后样液体积，mL；v——粗多酚抽滤后样液体积，mL；M——所用虎耳草的质量，g。（2）多酚提取率公式多酚提取率（%）=C其中：C——多酚样液浓度，µg/mL；V——多酚样液体积，mL；W——稀释倍数。2.4大孔吸附树脂对虎耳草多酚类物质的纯化2.4.1大孔吸附树脂的预处理方法大孔吸附树脂的工作原理是树脂本身与被吸附的物质之间存在范德华力，大孔吸附树脂存在多孔结构，能够对被吸附的物质产生筛选作用，由于树脂的比表面积较大而使物质吸附，根据吸附筛选的原理，通过使用一定的溶剂进行洗脱而将吸附能力不同以及分子质量不同的有机物质进行分离纯化，具有能将样品除杂，浓缩的优点。将新的大孔吸附树脂在95%乙醇中浸泡一天，去除部分有机杂质，然后不断用纯水冲洗至闻不到乙醇味。将纯水冲洗之后的大孔吸附树脂用浓度为5%的盐酸溶液浸泡12h后再次纯水冲洗，直到冲洗树脂后的废液用pH试纸检测为中性为止。再将纯水冲洗后的大孔吸附树脂用浓度为5%的氢氧化钠溶液浸泡12h后用纯水冲洗至废液用pH试纸检测为中性为止，晾干备用。2.4.2大孔吸附树脂上柱大孔树脂的湿法装柱步骤如下：（1）将玻璃柱上端的阀门打开下端阀门关闭，把玻璃柱垂直固定在桌面上，实验过程中要保持玻璃柱的垂直状态防止倾斜。（2）将处理后的大孔树脂用纯水冲入玻璃柱，注意冲水时动作要缓慢，避免速度过快而使玻璃柱中产生气泡，大孔树脂占玻璃柱体积约4/5即可。（3）如果在上柱过程中发现玻璃柱内存在气泡，可通过敲击玻璃柱使气泡上浮，如果气泡过多不易消除，则用纯水将树脂全部冲出后重新上柱，直到上柱效果满意为止。（4）在使用大孔吸附树脂纯化的过程中要保持湿润，液面高度要保持在树脂上方约3cm即可。（5）闭合上端开关，接通恒流泵即可使用。2.5高效液相色谱分析2.5.1HPLC实验准备选取合适的流动相并进行过滤防止存在微粒对设备造成损坏，保持流通池的湿润状态，将样品进行过滤后装入小瓶以便于液相色谱分析使用2.5.2HPLC操作流程（1）开机检查设备、流路、信号连接是否完好；（2）配制相应流动相，过滤膜；（3）配制标准溶液，过滤膜；（4）仪器自检、脱气、清洗柱塞杆、设置流速、流动相比例、平衡柱子等。（5）将样品放于样品托板的对应位置，并在计算机上对不同的样品进行标记处理。（6）待仪器预热完成且基线呈现平稳趋势后，开始对进样的粗多酚样品进行HPLC分析。（7）进样分析完毕，冲洗反向柱，关闭泵清洗仪器处理废液。2.6虎耳草多酚抗氧化性分析2.6.1测定虎耳草多酚对DPPH自由基清除率用电子天平准确称取5mmol/LDPPH加入体积为1L的无水乙醇配置成浓度为5mmol/L的DPPH酒精溶液，将多酚提取液用纯水分别稀释成55、110、220、330、440μg/mL的梯度浓度稀释液，取5只试管分别加入多酚提取液2mL、DPPH酒精溶液2mL后摇匀静止让其反应0.5h，用2mL无水乙醇和蒸馏水的混合溶液作为参比溶液在517nm处用紫外分光光度计测其吸光度记为Ai用2mL多酚样品液和无水乙醇的混合溶液作对照测其在517nm处吸光度记为Aj，用2mLDPPH酒精溶液与纯水的混合溶液作为对照组在517nm处测其吸光度记为A0，重复上述方法用抗坏血酸替代多酚样品进行试验并测定吸光度并计算出清除率。2.6.2测定虎耳草多酚对羟基自由基清除率取5支的试管,加入9.0mmol/LFeSO4溶液1mL,9.0mmol/L水杨酸-乙醇溶液1mL,不同质量浓度的虎耳草多酚梯度稀释溶液1mL,最后加入8.8mmol/LH2O21mL于室温下反应1h,在510nm处测定样品的吸光度Ai。以水代替多酚溶液为参比,测定对照组吸光度A0。以9.0mmol/LFeSO4,9.0mmol/L水杨酸-乙醇溶液,不同质量浓度的虎耳草多酚梯度稀释溶液,纯水1mL混合测定吸光度Aj。用同样的方法测定VC的吸光度。根据计算公式计算ꞏOH自由基清除率清除率=2.6.3测定虎耳草多酚对超氧自由基清除率在5支试管中分别加入3mLTris-HCl缓冲液(pH8.2),1mL不同质量浓度的虎耳草多酚梯度稀释液,30℃下保温20min,加入30℃下水浴锅中加热的7mmol/L的邻苯三酚溶液0.3mL反应5min后,加入1mL10mmol/LHCl溶液使反应停止,在420nm处测定该溶液吸光度Ai。以水为参比代替多酚,测定对照组吸光度A0。以纯水代替邻苯三酚混合测定吸光度Aj。用同样的方法测定VC的吸光度。平行测3次,取其平均值,计算O2_自由基清除率。

3结果及分析3.1多酚标准曲线的测定按照表3-1的试验方法配制出不同梯度浓度的没食子酸标准溶液。根据760nm处不同浓度的没食子酸溶液的吸光度绘制标准曲线，具体曲线见图3-1没食子酸体积（mL）福林酚体积（mL）15%碳酸钠体积（mL）没食子酸浓度(µg/mL)760nm处吸光度A015000.751510.1661.251520.2861.751530.4062.251540.5262.751550.6453.251560.764表3-1多酚标准曲线图3-1多酚标准曲线3.2闪氏提取法提取虎耳草多酚3.2.1最佳料液比的选择按照的实验步骤进行闪氏提取后将粗多酚液离心后用抽滤，取少量样液在760nm处用紫外分光光度计测出吸光值，分别计算出不同料液比乙醇溶液条件下的多酚提取率具体数据为表3-2和图3-2。表3-3料液比对虎耳草多酚提取率的影响料液比1:151:201:251:301:40多酚提取率1.43%1.59%1.77%1.91%1.85%图3-1料液比对虎耳草多酚提取率的影响对图3-2进行分析可知，随着料液比的变化多酚提取率表现出先升高后减小的明显趋势，在料液比为1:30时多酚提取率达到组高点故后续实验的料液比定为1:30。3.2.2最佳提取时间的选择按照节的实验步骤闪氏提取后将粗多酚液离心后进行抽滤，取少量样液在760nm处用紫外分光光度计测出吸光值，分别计算出不同的闪氏提取器工作时间条件下的多酚提取率。表3-3和图3-3为详细数据。表3-3提取时间对虎耳草多酚提取率的影响提取时间50s60s70s80s90s多酚提取率1.50%1.75%2.00%2.10%1.96%图3-3提取时间对虎耳草多酚提取率的影响对图3-3分析可知，多酚提取率随着提取时间的增加先呈现出上升趋势而在80s后又开始下降且提取率在80s时达到最高则后续实验将闪氏提取器工作时间设置为80s。3.2.3乙醇体积分数的选择按照的试验方法进行闪氏提取将提取后粗多酚液离心后用进行抽滤，取少量样液在760nm处用紫外分光光度计测出吸光值，分别计算出不同体积分数的乙醇溶液条件下的多酚提取率具体结果见表3-4和图3-4。表3-4不同体积分数的乙醇溶液对应的多酚提取率乙醇体积分数30%40%50%60%70%多酚提取率0.99%1.30%1.26%1.19%1.13%图3-4乙醇体积分数对虎耳草多酚提取率的影响根据散点图3-4可知，乙醇体积分数在30%至70%范围内所对应的多酚提取率呈现出先上升后下降的趋势，体积分数为50%时多酚提取率达到最大值，故后续实验的乙醇体积分数定为40%。3.2.4最佳提取电压的选择按照节的实验步骤闪氏提取后在将粗多酚液经离心后进行抽滤，分别取少量样液在760nm处用紫外分光光度计测出吸光值，分别计算出不同的闪氏提取器工作电压条件下的多酚提取率。表3-5和图3-5为详细结果。表3-5提取电压对虎耳草多酚提取率的影响提取电压40V50V60V80V100V多酚提取率1.30%1.45%1.66%2.00%1.86%图3-5提取电压对虎耳草多酚提取率的影响对图3-5分析可知，虎耳草多酚的提取率随着闪氏提取器工作电压的升高呈现出先增加后平缓最后趋近平衡的趋势可以判断多酚提取率在80V的工作电压下达到最高，故后续实验将闪氏提取器工作电压设置为恒定80V。3.3闪氏提取的正交试验为了得到闪氏提取虎耳草多酚的最优试验方法，后续实验将在单因素实验的基础上进行一系列正交试验确定不同的实验变量对实验结果影响程度的大小确定实验变量的优先级并根据实验结果进行极差分析得出的多酚提取率分析出最佳实验方案，具体实验内容见表3-6。表3-6闪式提取虎耳草多酚的正交实验编号酒精体积分数料液比电压提取时间多酚提取率（%）140%1:2080V60s1.55240%1:2590V75s1.34340%1:30100V90s1.71450%1:2090V90s1.27550%1:25100V60s1.31650%1:3080V75s1.71760%1:20100V75s1.27860%1:2580V90s1.49960%1:3090V60s1.56K14.64.094.754.42最佳组合为：A1B3C1D3K24.22K34.324.984.294.47k11.531.361.581.47k21.431.381.391.44k31.441.661.431.49R(极差)90.03根据表3-6分析可知通过极差分析法得出对闪氏提取实验结果影响最大的因素是料液比，其次为提取电压，再次酒精的体积分数，提取时间对多酚提取率的影响程度最小。按照得出结论进行验证试验发现当料液比为1：30、闪氏提取电压80V、酒精体积分数为40%、闪氏提取时间为90s时获得2.5%的最高提取率则可以确定正交试验得出的方案为最佳。3.6样品的高效液相结果分别将经过大孔吸附树脂纯化前后的虎耳草多酚样品进行液相色谱分析图3-9样品纯化前HPLC色谱图图3-10样品纯化后HPLC色谱图由上图可知样品中含有没食子酸和槲皮素。3.7虎耳草多酚的抗氧化性测定3.7.1对DPPH自由基的清除结果图3-11虎耳草多酚和VC对DPPH自由基清除作用比较根据实验结果绘图可知，VC具有极强的抗氧化能力，且抗氧化能力与VC质量浓度呈线性关系，在质量浓度为100μg/mL时dpph清除率就达到了70%，虎耳草多酚对dpph自由基的清除作用明显低于VC但仍具有一定的抗氧化性，随质量浓度的升高而缓慢上升。3.7.2虎耳草多酚羟基自由基的清除结果图3-12虎耳草多酚对羟基自由基清除作用和VC比较由实验结果绘图表明，虎耳草多酚和VC对羟基自由基的清除能力都很强，清除率与样品的浓度呈正相关趋势，虎耳草多酚浓度为0-100μg/mL时清除能力上升显著大于100μg/mL时缓慢升高，所以虎耳草多酚具有一定的抗氧化能力。3.7.3对超氧自由基的清除结果图3-13虎耳草多酚和VC对超氧自由基清除作用比较由实验结果绘图可知，虎耳草多酚对超氧自由基的清除率与质量浓度几乎呈线性趋势，在质量浓度约为220μg/mL时对超氧自由基的清除率高达100%，与对照品VC相比较，VC对超氧自由基具有很强的清除能力质量浓度为100μg/mL时清除率接近100%，因此虎耳草多酚具有良好的清除超氧自由基作用。3.7.4对ABTS自由基的清除结果图3-14虎耳草多酚和VC对ABTS自由基清除作用比较由实验结果可知虎耳草多酚与VC对ABTS自由基的清除能力较强在一定浓度范围内清除率与样品浓度呈线性关系，随样品浓度的升高而增强。

结论1、虎耳草多酚的闪氏提取实验的料液比1:30、体积分数40%、提取电压80V、提取时间90s时多酚的提取率为2.50%达到最大值。2、本实验采用X-5型大孔吸附树脂进行虎耳草多酚物质的纯化实验得出X-5型大孔吸附树脂的吸附率为75.80%解析率为88.65%。3、利用高效液相色谱法对虎耳草多酚纯化样品进行分析，测得其中多酚物质为没食子酸和槲皮素等。4、虎耳草多酚的抗氧化实验表明虎耳草多酚物质具有一定的抗氧化能力，尤其是对超氧自由基和ABTS自由基有较强的抗氧化性，对DPPH自由基清除能力有限。

参考文献[1]郑岩,王红霞,陈随清.虎耳草颗粒的质量控制方法[J].中国医药指南,2014,12(23):46-47.[2]王晓梅.中草药饲料添加剂在养殖生产中的作用[J].中国动物保健,2019,21(08):51-52.[3]雷瑾,张韫,王亚茹,专小凯,刘祎凡,孙晨菲.虎耳草素的提取工艺及药理作用研究进展[J].广州化工,2016,44(19):4-5.[4]张知侠.虎耳草精油化学成分及其抑菌活性[J].西北农业学报,2016,25(10):1536-1540.[5]Pandey,KantiBhooshan,SyedIbrahimRizvi.Plantpolyphenolsasdietaryantioxidantsinhumanhealthanddisease[J].OxidativeMedicineandCellularLongevity,2009(5):270-278.[6]冯丽,宋曙辉,赵霖,等.植物多酚种类及其生理功能的研究进展[J].江西农业学报,2007(10):105-107.[7]彭立影,刘功良,李南薇,等.蜂胶有效成分检测的研究进展[J].农产品加工,2019(04):75-78+83.[8]叶加兰,郭雅欣,林小妍,等.银杏叶黄酮化合物分离提取与纯化的研究进展[J].广州化工,2019,47(22):34-36.[9]江阳,杨硕,金晓,徐元庆,史彬林.艾蒿黄酮对肉仔鸡生长性能和肉品质的影响[J/OL].饲料研究,2021(06):54-57[2021-05-04]./10.13557/ki.issn1002-2813.2021.06.013.[10]韩建伟,胡昌奇.植物酚酸类及其酯和甙[J].国外医学.药学分册,1985(04):216-221.[11]冯小慧,邵文捷,李国银,等.亚麻木酚素提取方法研究[J].农产品加工(学刊),2014(01):30-31.[12]付伟,吴子龙,耿霄,等.单宁酸生物学功能及其应用前景[J].饲料研究,2019,42(11):108-111.[13]秦柯,郭雪君.姜黄素治疗慢性阻塞性肺疾病的相关机制研究进展[J].中国呼吸与危重监护杂志,2020,19(02):193-197.[14]左丽丽,王振宇,樊梓鸾,卢静.猕猴桃多酚的生理功能研究进展[J].食品研究与开发,2013,34(11):117-120+127.[15]刘晓艳,陈海光,叶思平,等.荷叶黄酮提取及对肉类腐败菌抑菌活性研究[J].食品研究与开发,2015(8):25-29.[16]李凤英,李润丰.葡萄籽中主要化学成分及其开发应用(综述)[J].河北职业技术师范学院学报,2002(02):65-67.[17]熊何健,周常义,郑新阳,吴国宏,杨秋明.葡萄籽多酚对高脂膳食小鼠降血脂和抗氧化功能的影响[J].江西农业学报,2008(01):105-107.[18]任彩君,吴黎明,王凯.膳食多酚对肠道菌群影响研究进展[J/OL].食品工业科技:1-17[2021-05-02]./10.13386/j.issn1002-0306.2020090112.[19]蓝蔚青,杜金涛,梅俊,谢晶.茶多酚抑菌机理及在水产品保鲜中的应用进展[J].包装工程,2021,42(05):73-79.[20]黄玉杰,吴彪,向平.粗枝木麻黄(Casuarinaglauca)小枝中缩合单宁提取条件的探讨[J].厦门大学学报.2005,6(44):32-36.[21]Giner-ChavezB,VanSoestPJ,RobeasonJB.Amethodforisolatingcondensedtanninsfromcrudeplantextractswithtrivalentytterbium[J].Joumalofthescienceoffoodandagriculture,1997(74):359-368[22]LuY,FooL.Y.Identificationandquantificationofmajorpolyphenolsinapplepomace[J].FoodChemistry,1997,59(2):187-194[23]ZinZ.M,HamidA.A,OsmanA.Antioxidativeactivitiesofc