生物化学 03-1 酶的热力学和动力学

生物化学/Biochemistry概念、理论、研究、应用Conception,theory,research,andapplication ——逻辑和自学

——LogicandLIY(LearnItYourself)第三章:酶

酶的热力学和动力学第一节

酶的分子结构与功能

TheMolecularStructureandFunctionofEnzyme什么是酶酶（德语：Enzym，源于希腊语：ενζυμον，“在酵里面”；又称酵素），指具有生物催化功能的高分子物质。目前将生物催化剂分为两类:酶、核酶（脱氧核酶）酶学研究简史公元前两千多年，我国已有酿酒记载。一百余年前，Pasteur认为发酵是酵母细胞生命活动的结果。1878年，Kühne首次提出Enzyme一词。1897年，EduardBuchner用不含细胞的酵母提取液，实现了发酵（获得1907年的诺贝尔化学奖）。1926年，Sumner首次从刀豆中提纯出脲酶结晶(deoxyribozyme)，证明了尿素酶的蛋白质本质（获得1946年度诺贝尔化学奖）。In1965,DavidChiltonPhillips的实验室得到第一个酶（溶菌酶）的X-衍射3D结构。1982年，Cech首次发现RNA也具有酶的催化活性，提出核酶(ribozyme)的概念（获1989年诺贝尔化学奖）。1995年，JackW.Szostak研究室首先报道了具有DNA连接酶活性DNA片段，称为脱氧核酶(deoxyribozyme)。酶催化反应体系底物酶先生产物在酶的催化反应体系中，反应物分子被称为底物，底物通过酶的催化转化为另一种分子，即产物。酶在工业和人们的日常生活中的应用也非常广泛。例如，药厂用特定的合成酶来合成抗生素；加酶洗衣粉通过分解蛋白质和脂肪来帮助除去衣物上的污渍和油渍。酶和蛋白质Protein绝大多数酶是蛋白质核算也可以是酶不是所有蛋白质都是酶NucleicacidEnzyme核酶长期以来认为所有酶都是蛋白质，直到1982年，ThomasCechandSydneyAltman首次发现RNA也具有酶的催化活性，提出核酶(ribozyme)的概念（获1989年诺贝尔化学奖）。RNA世界假说：生命进化的早期，没有蛋白质（酶），某些RNA可以催化RNA的复制——也就是说RNA是唯一的遗传物质，是生命的源头。酶的不同形式:单体酶(monomericenzyme)：仅具有三级结构的酶。寡聚酶(oligomericenzyme)：由多个相同或不同亚基以非共价键连接组成的酶。多酶体系(multienzymesystem)：由几种不同功能的酶彼此聚合形成的多酶复合物。多功能酶(multifunctionalenzyme)或串联酶(tandemenzyme)：一些多酶体系在进化过程中由于基因的融合，多种不同催化功能存在于一条多肽链中，这类酶称为多功能酶。同工酶(isoenzyme)：催化相同的化学反应，而酶蛋白的分子结构理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。同工酶同工酶(isoenzyme)是指催化相同的化学反应，而酶蛋白的分子结构理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。定义同工酶根据国际生化学会的建议，同工酶是由不同基因编码的多肽链，或由同一基因转录生成的不同mRNA所翻译的不同多肽链组成的蛋白质。同工酶存在于同一种属或同一个体的不同组织或同一细胞的不同亚细胞结构中，它使不同的组织、器官和不同的亚细胞结构具有不同的代谢特征。这为同工酶用来诊断不同器官的疾病提供了理论依据。乳酸脱氢酶的同工酶M(骨骼肌型)和H(心肌型)举例1由LDHA和LDHB基因分别编码M型和H型亚基后来还发现了第三种LDHC/LDHX基因仅在睾丸中表达人心肌、肾和红细胞中以LDH1和LDH2最多骨骼肌和肝中以LDH4和LDH5最多肺、脾、胰、甲状腺、肾上腺和淋巴结等组织中以LDH3最多HHHHHHHMHHMMHMMMMMMMLDH1

(H4)LDH2(H3M)LDH3(H2M2)LDH4(HM3)LDH5

(M4)蛋白质部分：酶蛋白(apoenzyme)辅助因子(cofactor)

无机分子：有机分子全酶(holoenzyme)辅酶辅基金属离子单纯酶(simpleenzyme)结合酶(conjugatedenzyme)酶的组份指空间结构上彼此靠近的具有特定空间结构的局部区域，能与底物特异结合并将底物转化为产物。酶的活性位点（Activesite）酶的活性位点（Activesite）酶分子中氨基酸残基侧链的化学基团中，一些与酶活性密切相关的化学基团。必需基团(essentialgroup)活性位点内的必需基团结合基团(bindinggroup)与底物相结合催化基团(catalyticgroup)催化底物转变成产物位于活性中心以外，维持酶活性中心应有的空间构象和（或）作为调节剂的结合部位所必需。活性位点外的必需基团底物（Substrat）e活性位点外必须基团结合基团（Bindinggroup）催化基团（Catalyticgroups)活性位点（Activesite）底物+酶酶底物复合物酶底物+酶底物复合物锁匙模型

-EmilFischer(1890)诱导契合模型-DanielE.KoshlandJr.(1958)诱导契合作用使酶与底物密切结合酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变形和相互适应，进而相互结合。这一过程称为酶-底物结合的诱导契合(induced-fit)

。举例：己糖激酶活性中心的诱导契合己糖激酶催化己糖磷酸化的过程中发生的剧烈构象变化。注：并非所有的酶都发生剧烈的构象变化一种酶仅作用于一种或一类化合物，或一定的化学键，催化一定的化学反应并生成一定的产物。酶的这种特性称为酶的特异性或专一性。酶的特异性(specificity)酶促反应的高度的特异性根据酶对其底物结构选择的严格程度不同，酶的特异性可大致分为以下3种类型：绝对特异性(absolutespecificity)：只能作用于特定结构的底物，进行一种专一的反应，生成一种特定结构的产物。相对特异性(relativespecificity)：作用于一类化合物或一种化学键。立体结构特异性(stereospecificity)：作用于立体异构体中的一种。立体结构特异性（stereo-specificity）第二节

酶反应的热力学和动力学

ThermodynamicsandKineticsofEnzyme-CatalyzedReaction酶反应的热力学和动力学没有酶的美军装备了酶的美军热力学：反应是否可能（战略）动力学：反应如何进行（战役）？过渡态（TransitionState）理论..底物产物过渡态DG（自由能）自由能（DG）化学反应进程DG

‡（活化能）反应进程中过渡态是最不稳定的状态过渡态和中间产物的差别过渡态非常不稳定，一般不能被跟踪到和被分离..底物产物过渡态DGrxn自由能（DG）化学反应进程中间产物过渡态（TransitionState）理论..底物产物过渡态DG（自由能）自由能（DG）化学反应进程DG

‡（活化能）酶降低了反应的活化能酶促反应（二）酶-底物复合物的形成有利于底物转变成过渡态酶底物复合物E+SE+PES(过渡态)（一）酶促反应具有极高的效率一、酶促反应的特点酶的催化效率通常比非催化反应高108～1020倍，比一般催化剂高107～1013倍。酶的催化不需要较高的反应温度。酶和一般催化剂加速反应的机理都是降低反应的活化能(activationenergy或Gibbsenergy)。酶比一般催化剂更有效地降低反应的活化能。活化能：底物分子从初态转变到活化态所需的能量。在反应前后没有质和量的变化；只能催化热力学允许的化学反应；只能加速可逆反应的进程，而不改变反应的平衡点。酶与一般催化剂的共同点：酶促反应动力学：研究各种因素对酶促反应速率的影响，并加以定量的阐述。影响因素包括：酶浓度、底物浓度、pH、温度、抑制剂、激活剂等。一、底物浓度对反应速率影响的作图呈矩形双曲线在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应速率的影响呈矩形双曲线关系。[S]V单底物、单产物反应；酶促反应速率一般在规定的反应条件下，用单位时间内底物的消耗量和产物的生成量来表示；反应速率取其初速率，即底物的消耗量很小（一般在5﹪以内）时的反应速率底物浓度远远大于酶浓度。研究前提：当底物浓度较低时：反应速率与底物浓度成正比；反应为一级反应。[S]VVmax随着底物浓度的增高：反应速率不再成正比例加速；反应为混合级反应。[S]VVmax当底物浓度高达一定程度：反应速率不再增加，达最大速率；反应为零级反应[S]VVmax中间产物（过渡态）解释酶促反应中底物浓度和反应速率关系的最合理学说是中间产物学说：

E+S

k1k2k3ESE+P（一）米－曼氏方程式揭示单底物反应的动力学特性1913年Michaelis和Menten提出反应速率与底物浓度关系的数学方程式，即米－曼氏方程式，简称米氏方程式(Michaelisequation)。[S]：底物浓度V：不同[S]时的反应速率Vmax：最大反应速率(maximumvelocity)

Ｋm：米氏常数(Michaelisconstant)

ＶVmax[S]

Km+[S]＝──E与S形成ES复合物的反应是快速平衡反应，而ES分解为E及P的反应为慢反应，反应速率取决于慢反应即V=k3[ES]——

(1)S的总浓度远远大于E的总浓度，因此在反应的初始阶段，S的浓度可认为不变即[S]=[St]。米－曼氏方程式推导基于两个假设：米－曼氏方程式推导过程：ES的生成速率=ES的分解速率k2+k3=Km

（米氏常数）

k1令：则(2)变为:([Et]－[ES])[S]=

Km[ES]——(2)=([Et]－[ES])[S]k2+k3[ES]k1整理得：k1([Et]－[ES])[S]=

k2[ES]+k3[ES]当反应处于稳态时：当底物浓度很高，将酶的活性中心全部饱和时，即[Et]=[ES]，反应达最大速率Vmax=

k3[ES]=

k3[Et](5)[ES]=

───[Et][S]Km+[S](3)

整理得:将(5)代入(4)得米氏方程式：Vmax[S]Km+[S]V=

────将(3)代入(1)得k3[Et][S]Km+[S](4)V=

────（二）Km与Vm是有意义的酶促反应动力学参数Km值的推导Km与Vmax的意义当反应速率为最大反应速率一半时：Km值的推导Km=[S]Km值等于酶促反应速率为最大反应速率一半时的底物浓度，单位是mol/L。2=Km+[S]VmaxVmax[S]VmaxV[S]KmVmax/2Km与Vmax的意义定义：Km等于酶促反应速率为最大反应速率一半时的底物浓度。意义：Km是酶的特征性常数之一，只与酶的结构、底物和反应环境（如，温度、pH、离子强度）有关，与酶的浓度无关。Km可近似表示酶对底物的亲和力；同一酶对于不同底物有不同的Km值。Km值

Vmax意义：Vmax=k3[E]定义：Vm是酶完全被底物饱和时的反应速率，与酶浓度成正比。如果酶的总浓度已知，可从Vmax计算酶的转换数(turnovernumber)，即动力学常数k3。酶的催化效率和转换数酶的催化效率可用酶的转换数(turnovernumber)

来表示。酶的转换数是指在酶被底物饱和的条件下，每个酶分子每秒钟将底物转化为产物的分子数。定义:当酶被底物充分饱和时，单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物的分子数。意义:可用来比较每单位酶的催化能力。1.双倒数作图法(doublereciprocalplot)，又称为林-贝氏(Lineweaver-Burk)作图法Vmax[S]Km+[S]V=（林－贝氏方程）+1/V=KmVmax1/Vmax1/[S]两边同取倒数（三）Ｋm值与Ｖmax值可以通过作图法求取-1/Km1/Vmax1/[S]1/V2.Hanes作图法在林－贝氏方程基础上，两边同乘[S][S]/V=Km/Vmax+[S]/Vmax[S][S]/V-Km

Km/Vm1/Vmax二、底物足够时酶浓度对反应速率的影响呈直线关系在酶促反应系统中，当底物浓度大大超过酶的浓度，酶被底物饱和时，反应速率达最大速率。此时，反应速率和酶浓度变化呈正比关系。当[S]＞＞[E]，酶可被底物饱和的情况下，反应速率与酶浓度成正比。关系式为：V=k3[E]0V[E]当[S]>>[E]时，Vmax=k3[E]酶浓度对反应速率的影响三、温度的影响具有双重性温度对酶促反应速率具有双重影响。酶促反应速率最快时反应体系的温度称为酶促反应的最适温度(optimumtemperature)。温度对淀粉酶活性的影响酶的最适温度不是酶的特征性常数，它与反应进行的时间有关。酶的活性虽然随温度的下降而降低，但低温一般不使酶破坏。温度回升后，酶又恢复其活性。四、pH改变酶和底物分子解离状态影响反应速率酶催化活性最高时反应体系的pH称为酶促反应的最适pH(optimumpH)。pH对某些酶活性的影响酶的最适pH最适pH不是酶的特征性常数，它受底物浓度、缓冲液种类与浓度、以及酶纯度等因素的影响。五、抑制剂可逆地或不可逆地降低酶促反应速率酶的抑制剂(inhibitor)酶的抑制区别于酶的变性：

抑制剂对酶有一定选择性引起变性的因素对酶没有选择性凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称为酶的抑制剂。抑制作用的类型不可逆性抑制(irreversibleinhibition)可逆性抑制(reversibleinhibition)竞争性抑制(competitiveinhibition)非竞争性抑制(non-competitiveinhibition)反竞争性抑制(uncompetitiveinhibition)根据抑制剂和酶结合的紧密程度不同，酶的抑制作用分为：

概念抑制剂通常以共价键与酶活性中心的必需基团相结合，使酶失活。不可逆（一）不可逆性抑制剂主要与酶共价结合分类：特异针对基团的试剂和底物结构不类似底物类似物自杀底物和底物类似，但需要被催化后才发挥抑制作用有机磷化合物路易士气失活的酶羟基酶失活的酶酸巯基酶失活的酶酸BAL巯基酶BAL与砷剂结合物注：不可逆并不代表不可救。特异针对基团的试剂活性位点的丝氨酸底物类似物结合活性位点不可逆改变活性位点自杀底物类似底物，能结合到活性中心（但还不抑制酶活），被酶催化发生正常的酶反应生成中间产物，中间产物导致酶活性的不可逆抑制，是更好的酶活性相关药物的候选者青霉素是1928年被ScottishdoctorAlexanderFleming发现的抗生素，是细菌细胞壁合成的抑制剂(theNobelprizeinMedicine).（二）可逆性抑制作用竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制类型概念抑制剂通常以非共价键与酶或酶-底物复合物可逆性结合，使酶的活性降低或丧失；抑制剂可用透析、超滤等方法除去。竞争性抑制作用的抑制剂与底物竞争结合酶的活性中心

有些抑制剂与底物的结构相似，能与底物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶－底物复合物的形成。这种抑制作用称为竞争性抑制作用。定义竞争性抑制+IEIE+SE+PESIS+++ESIESEIPEE竞争性抑制特点I与S结构类似，竞争酶的活性中心；抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力及底物浓度；动力学特点：Vmax不变，表观Km增大。抑制剂↑

无抑制剂1/V1/[S]竞争性抑制举例丙二酸与