生物技术-基因工程原理课件 第三章 核酸的分离纯化

第三章核酸的分离纯化

Chapter3Extraction&PurificationofNucleicAcid12/29/20241第一节核酸的分离纯化12/29/2024212/29/20243一、核酸分离、纯化原则保持核酸分子一级结构的完整性防止核酸的生物降解二、分离提取核酸的主要步骤细胞的破碎核蛋白的解聚、变性蛋白的去除核酸的沉淀核酸的浓度测定核酸的保存12/29/20244核酸(nucleicacid)是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。核酸样品质量将直接关系到实验的成败。前言12/29/20245一、核酸分离、纯化原则(一)保持核酸分子一级结构的完整性

1意义遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的—级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。

2分离核酸原则：温度不要过高；控制一定的pH值范围(pH值5-9);保持一定的离子强度;减少物理因素对核酸降解的机械剪切力。12/29/20246(二)防止核酸的生物降解细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。12/29/202471DNA酶抑制剂1）金属离子螯合剂：

DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2等。2）阴离于型表面活性剂：如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。12/29/202482RNA酶(RNase)抑制剂

RNAase分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱，不宜失活。常用的RNase抑制剂有：(1)皂土(bentonite)

作用机制：皂土带负电荷，能吸附RNase，使其失活。12/29/20249(2)DEPC(二乙基焦碳酸盐)(C2H5OCOOCOOC2H5)粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。使用注意：DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大100～1000倍。容易降解，保存在4℃或液氮中；提RNA时，0.1%DEPC浸泡器皿37℃2h。剧毒。12/29/202410(3)肝素(4)复合硅酸盐(Macaloid)(5)RNase阻抑蛋白(RNasin)(6)氧钒核糖核苷复合物(Vanadyl-RibonucleosideComplex,VRC)其它RNA酶抑制剂12/29/202411二分离提取核酸的主要步骤(一)细胞的破碎高速组织捣碎机捣碎玻璃匀浆器匀浆超声波处理法液氮研磨法化学处理法(SDS、吐温80等)生化法(溶菌酶、纤维素酶等)12/29/202412(二)核蛋白的解聚、变性蛋白的去除

核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。12/29/202413常用DNA提取方法：1加入10倍体积的缓冲液：10mMTris-HCl(pH7.4)；150mMNaCl;10mMEDTA;0.5%SDS。NaCl破坏核酸-蛋白质间的静电引力，使氢键破坏，核蛋白解聚；EDTA破坏细胞膜、敖合Ca2+，使DNase失活；

SDS可破坏细胞膜、抑制核酸酶，还可使核酸从蛋白质上游离出来。12/29/2024142加入蛋白酶K，蛋白酶K是一种非特异性蛋白酶。它可将蛋白质消化成氨基酸。一般工作浓度是50～100μg/ml。反应时间>5小时，反应温度55C。12/29/202415

3酚/氯仿抽提酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要充分混匀，为防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇(酚：氯：异戊醉=25：24：1)。12/29/202416酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。酚具有很强的结合水的能力，因此在使用前需要用pH8的10mMTris-HCl饱和后，加入抗氧化剂

-巯基乙醇和8羟基喹啉。酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。使用酚时应注意12/29/202417RNA提取时的注意事项RNA的提取多采用强变性剂，如异硫氰酸胍等。它不仅可以裂解细胞同时可以有效抑制RNase的活性。由于RNase无处不在，所以在进行RNA操作时应预防RNase的污染。如带一次性手套、高温烘烤玻璃器皿、DEPC处理液体和塑料制品等。酚用水饱和。12/29/202418带Poly(A)+RNA的分离原理：真核生物的mRNA的特点方法：Oligo(dT)-纤维柱磁珠标记的Oligo(dT)12/29/202419(三)核酸的沉淀沉淀是浓缩核酸最常用的方法。优点：①改变核酸的溶解缓冲液；②重新调整核酸的浓度；③去除溶液中某些盐离子与杂质。12/29/2024201DNA沉淀的盐类及浓度盐贮存液浓度（mol/L)终浓度(mol/L)MgCl210.01NaAc3(pH5.2)0.3KAc3(pH5.2)0.3NH4Ac102.5NaCl50.2LiCl80.812/29/2024212有机沉淀剂

(1)乙醇优点：对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除去。缺点：需要量大(2～3倍体积)。12/29/202422(2)异丙醇优点：需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。缺点：易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥发除去。12/29/202423(3)聚乙二醇(PEG)优点：可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量的DNA片段。应用6000相对分子质量的PEG进行DNA沉淀时，使用浓度与DNA片段的大小成反比。注意：

PEG沉淀一般需要加入0.5mol/L的NaCl或10mmol/L的MgCl2。12/29/202424(4)精胺(spermine)精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀DNA。原理是：精胺与DNA结合后，使DNA在溶液中结构凝缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质杂质与DNA分开，达到纯化DNA的目的。12/29/2024253核酸沉淀的温度和时间核酸沉淀应该在低温下长时间进行。若溶液中核酸浓度很高，在盐离子存在的情况下，加入异丙醇等后即可看到DNA的絮状沉淀。若溶液中核酸浓度很低，则需在－20C下过夜。酵母tRNA可有助nanogram级的核酸沉淀。大于10g/ml的核酸，冰浴10分钟即可有效沉淀。12/29/202426(四)核酸的浓度测定1紫外分光光度法测定核酸的含量在波长260nm紫外光下，1OD值的吸光度相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA和RNA为40μg/ml；寡核苷酸为35μg/ml。需要注意的是OD值范围应该在0.1～0.99之间，否则不符合上述线性关系。12/29/202427(五)核酸的保存1DNADNA样品溶于pH8.0的TE，4℃或-20℃或加1滴氯仿-70℃可保存数年。2RNARNA样品溶于0.3mol/LNaAc(pH5.2)加入2倍体积的乙醇中，-70℃保存;②在RNA溶液中，加1滴氯仿或0.2mol/LVRC(氧钒核糖核苷复合物)冻贮于-70℃,可保存数年。12/29/202428第三节核酸分子杂交技术

具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。

杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知核酸序列称探针。杂交有固一液相杂交和液相杂交。

一、核酸分子杂交的基本原理12/29/202429变性复性

DNA-DNA杂交双链分子二、DNA变性与复性(一)、DNA变性

1、定义：某些理化因素导致两条DNA链间的氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性12/29/2024302、变性的方法：（1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸分子链间的氢键完全断裂。（2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核酸分子链间的氢键断裂。（3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使双链核酸分子链间的氢键断裂。12/29/2024313、变性后的理化性质变化：粘度降低密度增加紫外吸收值增加12/29/2024324、DNA变性曲线

AT区先解链

GC区后解链阶梯式曲线12/29/2024335、GC含量与Tm值之间的关系（G+C）%=（Tm-69.3)×2.44Tm=(G+C)%×0.41+69.312/29/202434(二)复性

1、定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。12/29/2024352、复性过程单链分子间碰撞形成局部双链局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列形成完整的双链分子12/29/202436二、影响杂交的因素

1、核酸分子的浓度和长度：浓度越大，复性速度越快分子越大，复性速度越慢单链探针，浓度增加，杂交效率增加双链探针，浓度控制在0.1~0.5μg，浓度过高影响杂交效率12/29/2024372、温度：（1）DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低20~25℃

（2）RNA/DNA或RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低

Tm值（3）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低5℃12/29/2024383、离子强度：低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交率增加高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度

12/29/2024394、甲酰胺：甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在35~42℃杂交如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶液在68℃杂交

12/29/2024405、核酸分子的复杂性：核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序的总长度Cot½与反应体系中核酸复杂性成正比两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对杂交率取决于DNA的相对复杂性12/29/2024416、非特异性杂交反应：杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针的非特异性吸附常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分子化合物。如鲑鱼精子DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脱脂奶粉

12/29/202442第二节核酸分子杂交的方法按待测核酸是否固定在固相支持物上分：

固-液相杂交膜上印迹杂交原位杂交液相杂交

RNA酶保护分析法核酸酶S1保护分析法

12/29/202443一、Southern印迹杂交（一）待测核酸样品的制备

1、裂解或破碎细胞

2、抽取纯化基因组DNA3、限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段12/29/202444(二)待测DNA样品的电泳分离

1、琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶分离小片段用高浓度胶

2、凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子

DNA泳动慢,小分子DNA泳动快，大小相同的分子处于同一条带

3、分子量标准：经HindⅢ消化的λDNA，杂交所用分子量标准可用核素标记12/29/202445(三)凝胶中核酸的变性(碱变性)凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性为单链

DNA,中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液。使用稀HCl使DNA脱嘌呤，这样可以让DNA片段变短，提高转移效率。12/29/202446(四)Southernblotting(印迹)指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上的过程12/29/2024471、固相支持物的选择(1)理想的固相支持物应具备的特性①具有较强结合核酸分子的能力②不影响与探针的杂交反应③与核酸分子结合稳定牢固④具有良好的机械性能

非特异吸附少12/29/202448(2)常用的固相支持物①硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本底低。缺点是DNA分子结合不牢固②尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高③化学活化膜：优点：DNA与膜共价结合；对不同大小的DNA片段有同等结合能力；缺点：结合能力较上述两种膜低12/29/2024492、Southern印迹的常用方法

(1)毛细管虹吸印迹法利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。12/29/202450基本原理：容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上。12/29/202451(2)电转法利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。12/29/202452(3)真空转移法此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤维素膜上。12/29/202453

(五)Southern杂交

1、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点预杂交液为不含DNA探针的杂交液

2、杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交

3、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的DNA

12/29/202454(六)杂交结果检测

1、放射自显影：适用于放射性核素标记的探针

2、比色或化学发光检测：适于非核素标记的探针12/29/20245512/29/202456(七)Southernblotting的应用

1、酶切图谱分析

2、特定基因定性和定量

3、基因突变分析

4、限制性片段长度多态性的分析12/29/202457二、Northern

blotting杂交

1、基本原理和基本过程与Southernblot基本相同

2、对待检样品中mRNA的长度和丰度进行分析

3、探针可用DNA或RNA片段

4、待测样品为总RNA或mRNA12/29/202458Northern与Southernblotting的不同点

1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳中不变性

2、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理,Southern印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理

3、靶核酸为RNA12/29/202459三、斑点及狭缝印迹杂交

1、斑点印迹为圆形

2、狭缝印迹为线状

3、鉴别DNA、RNA4、简单、快速，同一张膜可检测多个样品

5、特异性不高、不能鉴别核酸分子量12/29/202460四、原位杂交(insituhybridization)

1、定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA杂交12/29/202461保持组织细胞的形态对核酸无抽提，修饰与降解作用不改变核酸在组织细胞内的定位不阻碍核酸与探针的杂交过程对杂交信号无遮蔽作用理化性质稳定2、杂交过程：(1)组织或细胞的固定理想固定液应具备：什么最好？多聚甲醛12/29/202462(2)组织细胞杂交前的预处理去垢剂(如Tritonx-100和SDS)和蛋白酶K去除核酸表面的蛋白质组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻片上脱落12/29/202463(3)探针的选择与标记以获得最好杂交效果为依据选择探针探针的长度一般为50~300bp,有时达1.5kb

放射性核素标记探针敏感性高，操作简便稳定检测结果分辨率高，但信号检测时间长

非核素标记探针安全、稳定性好、显色快，易于观察12/29/202464(4)杂交杂交液体积小：10~20μl

cDNA和RNA探针杂交温度约为50℃

杂交时间:DNA探针杂交为2~4h,RNA探针杂交过夜

杂交前一般将组织切片置95℃5~15分钟使DNA变性冲洗温度一般不超过50℃12/29/202465(5)杂交结果检测所用探针为核素标记,放射自显影检测

所用探针为非核素标记,比色或化学发光检测12/29/202466端粒原位杂交图12/29/202467五、液相杂交指待测核酸和探针都存在于杂交液中，碱基互补的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子的过程。12/29/202468(一)RNA酶保护分析法1、RNA酶保护分析法原理RNaseA和RNaseT1专一水解杂交体系中的单链RNA，不水解探针RNA与待测RNA互补形成的双链RNA，使杂交分子得到保护，称RNA酶保护分析法。12/29/2024692、杂交过程

制备待测RNARNA探针的制备与标记：体外转录法制备和标记RNA探针杂交：待测RNA与RNA探针在液相中杂交

RNaseA和RNaseTI除去单链RNA

电泳分离RNA

放射自显性检测杂交结果12/29/202470(二)核酸酶S1保护分析法

1、原理核酸酶S1在一定条件下专一水解杂交体系中的单链DNA和单链RNA，不水解DNA探针与待测RNA杂交形成的杂交体，使杂交分子得到保护，称核酸酶S1保护分析法12/29/2024712、杂交过程制备待测RNA：总RNA或mRNA均可单链DNA探针的制备与标记杂交：单链DNA探针与待测RNA在液相中杂交核酸酶S1除去单链DNA和单链RNA

电泳分离DNA/RNA杂交体分子放射自显影检测杂交结果12/29/202472第三节探针的标记一、探针的种类

基因组DNA探针

cDNA探针

RNA探针

寡核苷酸探针12/29/202473二、标记物

(一)理想标记物应具备的特性：

高度灵敏性不影响碱基配对的特异性不影响探针分子的主要理化性质对酶促反应活性无影响或影响不大检测方法具有高度灵敏性和高度特异性12/29/202474(二)标记物种类核素标记物：32p、35s、3H

非核素标记物半抗原：生物素、地高辛配体：生物素是亲和素的配体荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明等化学发光探针：标记物与某种底物反应发光，如生物素酰化的碱性磷酸酶可使发光底物发光

12/29/202475三、标记方法

体内标记法：将核素标记的化合物作为合成代谢的底物，在细胞合成代谢时使核素掺入到新合成的核酸分子中，如3H-胸苷可掺入到DNA中，3H-尿苷可掺入到RNA中

12/29/202476体外标记法：

化学标记法：标记物分子上的活性基因与