(新版)新型DNA酶生物传感技术在肿瘤液体活检中的研究进展

增加，使其成为人类生命的重大健康挑战[1]。液体活检通过分析体液中的生物标志物，如循环肿瘤DNA(circulatingtumorDNA,ctDNA)、循环肿瘤细胞(circulatingtumorcell,CTC)和肿瘤来源细胞外囊泡(tumorextracellularvesicle,TEV)等，以跟踪肿瘤的动态进展，实现无创、全面的分子分析[2],生物传感器通过测量标志DNA酶作为一种新兴功能核酸，基于其良好的化学稳定性、可编程性、便于表面固定和信号转导功能化等优势，已广泛用于各种液体活检策略，其中最为常见的为G-四链体DNA酶和RNA切割活性DNA酶。本综述将系统总结基于DNA酶的生物传感器在肿瘤液体活检研究中的最新进展，三维结构而具备特异结合和序列识别等功能[4]。1994年，Gerald的磷酸二酯键的转酯化反应。基于体外选择-指数富集配体系统进化(SELEX)技术的发明[6],在过去三十年里科研人员已经鉴定出各种具有催化活性的人工DNA序列，统称为DNA酶。不同的DNA酶特方式方便地用信号标签或纳米颗粒进行标记以产生各种类型的读出信号，例如用于激活DNA纳米机器的催化剂和用于组装DNA纳米结构的构建块 [7,8]。同时，与蛋白质酶或核酶相比，DNA酶化学性质稳定，在期和回收利用能力。DNA酶具有高催化效率，速率高达1010,催化效杂交链式反应(hybridizationchainreaction,HCR)和催化发夹组装底物的催化反应。目前在生物传感中应用最广泛的是8-17DNA酶和2.8-17DNA酶：2017年，Liu等[13]报道了8-17DNA酶的三维结构。经典的8-17DNA酶具有14个核苷酸的催化核心，其中9个核苷酸在催化核心结构域，5个核苷酸在单链结构域。 等存在下，进而形成2',3'-环状磷酸和5'羟基末端的RNA片段。而是2',3'-环状磷酸酯的水解[17]。随后的研究表明，除催化核心以外的其他位置的核苷酸取代、添加和删除具有良好的耐受性[18]。Mg2+浓度(10mmol/L或以上)下该DNA酶的催化常数(kcat)仍其催化核心由15个脱氧核苷酸组成，切割位点位于RNA分子上的2个生2'(3')-环磷酸和5'羟基末端的切割产物[20]。每个二核的DNA链通过分子内或分子间霍氏氢键形成的核酸三维二级结构[15]。G-四链体可以由1条、2条或4条富含G的DNA链组成，K+的存在可以进一步稳定G-链体的结构[22](表1)。20世纪90年代末报告了结合氯化血红素的G-四链体表现出过氧化物酶的浓度[25]。鲁米诺和四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)也通常用作G4/hemin如量子点、银纳米簇、铜纳米颗粒、荧光染料等[26]。1.循环肿瘤核酸检测：循环肿瘤核酸包括ctDNA和循环肿瘤RNAmRNA)、微小RNA(microRNA,miRNA)和长非编码RNA(long进展的病理过程，并提示良性或恶性病变的存在[42]。针对ctDNAAuNPs-DNA附着提供大的比表面积。该策略检测限为3.0×10-16mol/L。Xu等[28]报道了一种双茎发夹探针的比色生物传感器，放大的表面增强拉曼散射(surface-enhancedramanscattering,SERS)传感器，用于测定miRNA-21,该策略在0.5fmol/L至10nmol/L范围内对miRNA-21的检测具有良好的线性，检测限为0.5fetoprotein,AFP)、前列腺特异性抗原(proPSA)等。Wei等[31]利用适配体触发等温扩增和DNA酶双重信号放大构建了新型超灵敏荧光适配体传感器用于检测血液中CEA,可达一种基于三重信号放大的便携式比色生物传感器，该仪器将DNA酶催化和分子信标与阳离子交换反应相结合，可灵长因子BB,浓度3.16×10-16~3.16×10-12mol/L,检测限为0.11的电化学传感器用于检测CEA,线性响应范围为10fg/ml至200ng/ml,在检测蛋白质肿瘤标志物策略中，蛋白质信号转3.TEV检测：EV是一类具有磷脂双分子层的纳米级细胞外囊泡(40~160其中肿瘤来源细胞外囊泡在肿瘤免疫抑制、发挥关键作用[43]。在磷脂双分子层上高表达的特异性蛋白(如簇状胶体果胞抗原-63、表皮生长因子受体、上皮细胞黏附分子)常被用作检测癌症相关TEV的生物标记物。最近，人们广泛关注并努力开发灵敏而简单的TEV检测方法，如表面增强拉曼散射、表面等离子体共振、微流控和电化学等传感平台[44]。DNA酶在生物传感平台中用作生物分子识别元件增加传感平台的选择性，源性TEV的精准检测。Gao等[34]开发了在丁醇加速条件下的piRNA-20365,对MCF-7EV的检测限分别为3.98或2.69颗粒/μl。好的定量关系。Zhang等[35]创建了一种基于DNA酶诱导的DNA的TEV。通过双探针识别，DNA步行器的连续运动实现大量底物链的裂解，从而实现了信号放大，电流信号检测限可以达到3.63×104颗粒/ml。存在时，适配体球形核酸可以通过TEVs的桥接效应附着在微板上，从而触发HCR。这个过程伴随着大量的G-四链体DNA酶的形成，使TEV能够进行视觉定量分析，并达到50颗粒/μl的检测限。由于TEV尺寸仅为40~160nm左右，因此原位精确测定单个TEV内容物是一项重大挑战，Sun等[45]创新的将微囊泡膜融合技术与DNA酶技术相结合创建真地鉴定TEV内容物，对TEV内容物miRNA的检测限可低至46.5为102~103颗粒/μl。这些技术与DNA酶技术的结合具有潜在科研前与肿瘤转移过程密切相关[47]。CTC携带了蛋白质和核酸等关键 (PdRu/Pt)分层结构，在DNA酶的辅助下检测CTCs,该策略检测限低至2个细胞/ml,检测范围宽至2~106个细胞ml。Xiong等[38]限低至1个细胞/ml,外周血中MCF-7细胞的回收率94.0%~104.5%,SERS信号与MCF-7细胞浓度之间具有良好的线性关系。通过检测各种癌症外周血中的CTC可以获得大量有关原发肿瘤检测、疾病进展和预后跟踪的信息。针对CTC分离检测，目前基于DNA酶的生物传感具有高特异度、高灵敏度和操作便捷等优点，胞污染等不足。其中最具挑战性的部分是不的CTC性质各不相同，这进一步增加了分离和鉴定过程的复杂性。骤和昂贵仪器，新型DNA酶生物传感器没有放射性危害、耗时和程序繁研究显示去甲基酶的失调与多种疾病密切相关。细胞核内调节m6A水平的脂肪量和肥胖相关蛋白(fatmassandobesityassociatedprotein,为5.96×10-16mol/L,还能准确区分健康人和乳腺癌患者组织中的FTO表达水平。Yang等[40]提出了一种基于靶标调控的DNA酶裂解的均相电化学发光测定FTO的方法，检测限为30fmol/L,电化学发光强度与FTO浓度的对数在0.0001~100nmol/L范围呈线性相关。Shi等[41]提出了一种基于三重信号放大的比色生物传感器，FTO催化的m6A笼状DNA酶的去甲基化被设计为启动下游反应的开关，且DNA酶可以在底物裂解后回收，检测限低至69.9fmol/L。近年来，DNA酶在检测病毒和细菌病原体、癌症生物标志物和调节性疾病生物标志物方面取得了较大进展。未来随着技定