DB51T 1539-2012 油菜根肿病菌土壤带菌PCR检测技术规程　

DB51DB51/T1539—2012油菜根肿病菌土壤带菌PCR检测技术规程2012-12-20发布2013-03-03实施四川省质量技术监督局发布I 1 1 14试剂及材料 2 2 2 3 3附录A(资料性附录)油菜根肿病基本信息 4Ⅱ本标准附录A为资料性附录。本标准按照GB/T1.1—2000规则进行编写。本标准由四川省农业厅提出并归口。本标准由四川省质量技术监督局批准。本标准起草单位：四川省农业科学院植物保护研究所。本标准主要起草人：刘勇、黄小琴、张蕾、尹全、刘红雨、周西全、杨晓蓉。11范围2规范性引用文件件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682-1992分析实验室用水规格和试3原理油菜根肿病是由芸薹根肿菌(PlasmodiophorabrassicaeWoron)引起的专性寄生性土传病害。该菌属原生动物界、根肿菌门根肿菌纲根肿菌(Plasmodiophora),主要侵染十字花科作物，通过农事操作、种苗带菌、灌溉等多种方式进行传播。病原菌以休眠孢子(囊)随病残体在土壤中越冬，在土中能4试剂及材料除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682-19—-溶菌酶。——三氯甲烷(CHCl₃)。———异戊醇(C₅H₁₂O)。———异丙醇(C₃H₈O)。——无水乙醇(CH₈O)。2——电泳缓冲液TAE:242gTris,57.1mL冰乙酸，100mL0.5mol/LEDTA(pH8.0),加蒸馏水—PCR引物：根据GenBank上已发表的根肿病菌基因片段序列，设计特异性引物。P2:5'-AGTTCGCTGCGTTCTT——阳性对照和阴性对照：以根肿病发病植株根部休眠孢子(囊)DNA提取液为阳性对照，以不发5仪器和设备——涡旋仪。——微量分光光度计。——移液器：2.5μL,10μL,20μL,100μL,1000μL。6田间土壤取样品采用“S”形采集法，用不锈钢土壤取样器采集0~15cm耕层土壤，每个土样由15个样点组成，等量混合后采用四分法采取1kg土样装入干净塑料自封袋。一个土样用一个土壤取样器或用75%酒精消毒土壤取样器后再使用。土壤取样点分布范围根据种植面积大小确定(表1)。表1油莱根肿病田间土壤带菌检测取样标准种植面积(m²)以田块为单位进行土壤取样7实验室检测液，10000r/min离心3min,弃上清液，重复操作2次。在装有土壤的2mL离心管中加入0.2g灭菌玻37℃水浴30min,上下颠倒离心管数次，水浴结束后加入0.5mLSDS缓冲液，68℃水浴30min,期间上下颠倒离心管数次，10000r/min离心5min,收集上清液。按上述方法再把残渣抽提1次。在上清液3中加入等体积的三氯甲烷/异戊醇(24:1,V/V),颠倒混匀放置10min,10000r/min离心5min,收集上清液。加入2/3倍体积的异丙醇，-20℃沉淀30min,12000r/min离心5min,弃上清液。沉淀用70%乙醇洗涤1次，混合10重复DNA抽提液，冷冻干燥后溶于50μLTE缓冲液中，微量分光光度计测定记录将土壤中提取的根肿病菌DNA稀释至100ng/μL,取稀释后的DNA溶液1μL,加入到扩增反应体系中，变性95℃30s、退火58℃30s、延伸72℃30s,35个循环；72℃保温7min,4℃保存。7.3琼脂糖凝胶电泳在电泳缓冲液中加入2%琼脂糖，加热融化后冷却至55℃左右加入5μLDNA荧光染料(GV)制备凝胶，凝固后进行电泳。5μLPCR扩增产物加入上样孔，80v恒压电泳25min,将电泳后的凝胶移入凝胶成像系统成像检测，记录成像结果。8结果及判断8.1试验结果成立条件阳性对照经PCR扩增反应后出现498bp大小条带，而阴性对照和空白对照不出现任何条带，试验结果成立，反之则不成立。8.2结果判断在试验结果成立的前提条件下，土壤样品DNA扩增出与阳性对照一样的498bp条带，则说明土壤中携带根肿病菌休眠孢子浓度大于等于10⁴个/g。9废弃物处理检测过程中的废弃物，收集后高压灭菌处理。4(资料性附录)A.1病原及其分类地位A.2病原特征根肿病菌的休眠孢子囊在寄主根部薄壁组织细胞内形成，球形或扁圆形、单胞、无色或略带灰色，结构穿透寄主细胞