紫外可见分光光度法

《仪器分析》课程紫外-可见吸收光谱法第一章第一章紫外-可见光光度法§1基本原理

§2化合物的紫外-可见吸收光谱

§3紫外-可见分光光度计结构与原理

§4应用

§5实验技术§1基本原理

紫外-可见分光光度法是利用物质对紫外-可见光的吸收特征和吸收强度进行定性和定量的仪器分析方法。一、光的基本性质

光是一种电磁波，具有波粒二象性。

(1).光的波动性

可用波长

、频率

、光速c等参数来描述：

=c/

波谱区域的划分微波可见光、紫外光的波长范围分别为多少？可见光：400-780nm紫外光：200-400nm(2).光的粒子性光是由光子组成，光子具有能量。光子的能量：

E=h=h·c/

（普朗克常数：h=6.626×10-34J·S)

光子能量与它的频率成正比，与波长成反比，与光强度无关。光的波长越短（频率越高），其能量越大。单色光：复合光：可见光：同一波长的光称为单色光；不同波长的光组成的光称为复合光；凡是被肉眼感受到的光称为可见光；

波长范围为400-780nm复合光单色光吸收黄色光反射蓝色光物质颜色的产生吸收绿色光透过紫色光固体液体互补色二、物质对光的选择性吸收

E=E1-

E0=h=hc/λλ=hc/

EM+

h

M*基态激发态E0

（△E）E1E2E1E0基态激发态

E物质对光选择性吸收例题

某分子中两个电子能级之间的能级差为1eV，若要电子在两个能级之间发生跃迁，需要吸收光的波长为多少纳米？（1eV=1.602×10-19J）解：根据注意：统一单位！！！！

用不同波长的光依次透过待测物质，并测量物质对不同波长的光的吸收程度（吸光度），以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得到该物质在测量波长范围内的吸收曲线。吸收曲线三、光谱的吸收曲线2.光谱的吸收曲线①同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长λmax②不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似，λmax不变。但在同一波长处的吸光度随溶液浓度增加而增大，定量分析依据。图为KMnO4水溶液的吸收曲线③不同物质吸收曲线特性（曲线形状、峰的数目，位置，强度）不同。可作为物质定性分析的依据。图1为KMnO4水溶液的吸收曲线图2为苯溶液的吸收曲线定量的依据是什么？？光强度：单位时间（1s）内照射在单位面积（1cm2）的上光能量。I表示。透射率：透过的光强度It与入射光强度I0之比，表示为：吸光度：物质对光的吸收程度

A

＝－lgT四、光的吸收定律四、光的吸收定律1.朗伯–比尔定律布格(Bouguer)和朗伯(Lambert)先后于1729年和1760年阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关系：1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物浓度之间也具有类似的关系:A=K1

b

A=K2

c二者的结合称为朗伯-比耳定律，其数学表达式为：A=

kbc

朗伯－比尔定律：A：吸光度；K：比例常数；

b：吸收介质的厚度，一般以cm为单位；

c：吸光物质的浓度，单位可以是g/L或mol/L。A＝

kbc

k？k-吸光系数K—吸光系数，液层厚度为1cm的单位浓度溶液，对一定波长光的吸光度k越大，表示该物质对光的吸收能力越强k

的两种表示方式：摩尔吸光系数质量吸光系数溶液以mol/L

为单位，K为摩尔吸光系数（ε），单位L·mol-1·cm-1，A=εbc例题某化合物的λmax=280nm，光线通过该化合物的1.0×10-5mol·L-1溶液时，透射率为50%（用2cm吸收池），求该化合物在280nm处的摩尔吸光系数。解：已知，

λmax=280nm，c=1.0×10-5mol·L-1，

T=50%，b=2cm则

A=-lgT=-lg0.5=0.301根据朗伯-比尔定律

A=ε·b·c

ε==0.301/（2×1.0×10-5

）

=1.51×104（L·mol-1·cm-1）Abc

多组分混合体系中，如果各组分分子之间不存在离解、聚合、化学反应等化学平衡时，其吸光度具有加合性，即：2.朗伯-比尔定律的应用---吸光度的加合性A总λ=A1λ+A2λ+…Anλ3.朗伯—比耳定律偏离的原因这种现象称为对朗伯—比耳定律的偏离。1.00.50AC正偏离负偏离A=

kbc

（1）.浓度的限制稀溶液Beer定律的假定：只有在稀溶液时才基本符合。当溶液浓度C>0.01mol/L

时，吸光质点间可能发生缔合等相互作用，直接影响了对光的吸收。引起这种偏离的因素（2）.非单色入射光引起偏离Lambert–Beer定律的前提条件之一是入射光为单色光。但实际上难以获得真正意义上的纯单色光。分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光普通带。复合光可导致对朗伯-比耳定律的正或负偏离。e.g.铬酸盐或重铬酸盐溶液中存在下列平衡：CrＯ42-＋2H＋

=Cr2Ｏ72-＋H2Ｏ

CrＯ42-、Cr2Ｏ72-的吸光性质不同，即ε(λ)不同。此时溶液pH对测定有重要影响。（３）.溶液发生化学变化引起偏离作业P262-5,14§1.2化合物的紫外-可见吸收光谱一、有机化合物的紫外—可见吸收光谱1、有机化合物的电子跃迁有机化合物的紫外吸收光谱，取决于分子中外层电子的性质。有机化合物分子中通常有三类电子：σ电子、π电子、n电子一、有机化合物的紫外一可见吸收光谱1.跃迁类型分子轨道理论：单键σ电子双键π电子未成键n电子吸收△E跃迁σ*反键轨道π*反键轨道成键轨道电子能级及电子跃迁sp

*s*RKE,Bnp

ECOHnpsH电子跃迁的类型σ→σ*n→σ*π→π*n→π*四种跃迁的能量大小顺序为：△Eσ→σ*>△E

n→σ*>△E

π→π*>△E

n→π*

（1）σ→σ*跃迁：这是一切饱和有机化合物都可能产生的电子跃迁类型，跃迁需要能量大，吸收短波长的辐射,<200nm，如甲烷的λmax为125nm,乙烷λmax为135nm。因此可以作为分光光度法的溶剂。（2）n→σ*跃迁：含有杂原子（如N、O、S等）的饱和烃衍生物都可发生这种跃迁。所需能量较大。吸收波长为150～250nm，大部分在远紫外区，近紫外区仍不易观察到。如一氯甲烷、甲醇n→σ*跃迁的λmax分别为173nm、183nm。（3）π→π*跃迁：不饱和烃、共轭烯烃和芳香烃类均可发生该类跃迁，如乙烯π→π*跃迁的λmax为170nm。（4）n→π*跃迁：分子中孤对电子和π键同时存在时发生n→π＊跃迁。丙酮n→π＊跃迁的λmax为275nm。（5）电荷迁移跃迁：分子本身具有电子给予体和电子接受部分，外来辐射照射，电子从具有给予体特性的部分转移到具有电子接受体特性的部分所发生的跃迁。其谱带较宽，吸收强度大。例：NCH3CH3－+hv电子接受体电子给予体A.生色团2.紫外光谱常用术语是指分子中产生吸收带的主要官能团（通常含有π键）；吸收带的λmax＞210nm,属于π→π*

或n→π*

等跃迁类型。生色团为不饱和基团：C=C、N=O、C=O、C=S等；B.助色团是指分子中的一些带有非成键电子对的基团本身在紫外-可见光区不产生吸收，但是当它与生色团连接后，增强生色团的生色能力，使生色团的吸收带向长波移动，且吸收强度增大。助色团为含有未共用电子对的杂原子基团：-OH、-Cl、-BrC.红移与蓝移

有机化合物的吸收谱带常常因引入取代基或改变溶剂使最大吸收波长λmax和吸收强度发生变化:

λmax向长波方向移动称为红移，向短波方向移动称为蓝移(或紫移)。D.增色效应和减色效应吸收强度即摩尔吸光系数ε增大或减小的现象分别称为增色效应或减色效应，如图所示。3.影响紫外-可见吸收光谱的因素（1）共轭效应

共轭体系的形成使λmax红移，并且共轭体系越长，紫外光谱的最大吸收越移向长波方向。CH2＝CH2

λmax为170nm左右，ε＝1×104L·mol-1·cm-1

CH2＝CH－CH＝CH2

λmax为210nm，ε＝2.1×104L·mol-1·cm-1

（2）溶剂效应物质在溶液中测定，因使用溶剂不同而产生不同的吸收光谱。溶剂的影响1：乙醚2：水12250300亚异丙基丙酮非极性→极性n

→

*跃迁：蓝移；；

→*跃迁：红移；；CH3COCHC(CH3)2n

→

*跃迁

→*跃迁n

→

*跃迁

→*跃迁

→*跃迁n

→

*跃迁（1）π→π*跃迁所产生的吸收峰随着溶剂极性的增加而向长波长方向移动（红移）。（2）n→π*跃迁所产生的吸收峰随溶剂极性的增加而向短波长方向移动（蓝移）。（3）溶剂pH值对光谱的影响如Fe3+与水杨酸在不同pH条件下的配合物（a）苯酚的UV光谱图（b）苯胺的UV光谱图溶液酸碱性对紫外光谱的影响4、常见有机化合物的紫外-可见吸收光谱（1）饱和烃及其取代衍生物烷烃

C—C，C—H只产生σ→σ*

跃迁，λmax＜150nm，在近紫外区无吸收。因而饱和烷烃可用作紫外吸收测定的溶剂。如，CH4λmax=125nm；

CH3CH3λmax=135nm饱和烃上H被杂原子取代σ→σ*红移，并产生n→σ*

跃迁。

n→σ*仍在远紫外区；如：

CH4:σ→σ*125nm，

CH3cl:n→σ*173

nm（2）不饱和烃及共轭烯烃σ、π：σ→σ*跃迁、π→π*跃迁单个双键，隔离双键：π→π*跃迁，吸收峰在远紫外区，乙烯170nm，1,5-己二烯185nm共轭双键：

π→π*跃迁红移，增色，

共轭双键中π→π*跃迁所产生的吸收带称为K带，其特点是强度大（ε＞104），λmax≥217nm，K带的λmax、εmax与共轭体系的数目、位置、取代基的种类有关。（3）芳香族化合物

苯：具有环状共轭体系，由π→π*产生三个吸收带：

E1184nm4.7×104E2203nm7.9×103B255-230nmB带是由于π→π*跃迁和苯环的振动重叠引起，也称为精细结构吸收带。B带是芳香族化合物的重要特征吸收带。思考1、庚烷、环己烷等烷烃在200-400nm内有无吸收？2、甲苯、丁二烯在200-400nm内有无吸收？3、如果环己烷中含有少量的杂质苯，其紫外吸收曲线会怎样?

作业P2617第三节紫外-可见分光光度计结构与原理一、基本组成光源单色器吸收池检测器显示系统1.光源作用：供给符合要求的入射光。要求：具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。

可见光区：钨灯、碘钨灯作为光源，其辐射波长范围在320～2500nm。紫外区：氢、氘灯。发射160～375nm的连续光谱。氘灯钨灯

作用：将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长单色光的光学系统。①入射狭缝：光源的光由此进入单色器；②准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束；③色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅；④聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；⑤出射狭缝。2.单色器心脏3.吸收池（比色皿）（1）吸收池作用：盛放液态样品的器皿（3）规格：几mm-几cm，1cm（2）吸收池种类：玻璃，对紫外有吸收，可见光区

石英，可见及紫外光区（4）材料、光学特性、光程长度影响测量结果

吸收池要挑选配对，使它们的性能基本一致（5）吸收池的形状可拆卸圆形测量池两面透光圆形测量池两面透光1cm长方形测量池两面透光气体测量池两面透光微量测量池两面透光流动测量池两面透光（6）使用比色皿的注意事项1.拿取比色皿时，只能用手指接触两侧的毛玻璃，不可接触光学面。毛面光面2.装溶液时，最好为比色皿的2/3高度处，不可太满（溢出）。4.凡含有腐蚀玻璃的物质溶液，不能长时间盛放在比色皿中。5.使用后立即用水冲洗干净。3.测量前，必须擦干比色皿外壁溶液，只能用擦镜纸或丝绸擦拭光学面。4.检测器（1）作用：光电转换元件

检测单色光通过溶液被吸收后透射光强度光信号转变为电信号

（2）种类：光电池、光电管和光电倍增管应用广泛硒电池、少用5.信号处理及显示系统作用：放大信号并以适当的方式指示或记录检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理。二、紫外-分光光度计的类型波长范围紫外-可见分光光度计（751型分光光度计）可见分光光度计（721，722型分光光度计）光路结构单光束分光光度计双波长分光光度计双光束分光光度计721型分光光度计1801型紫外-可见分光光度计1.单光束分光光度计优点：结构简单、价格低廉．缺点：受光源、检测器的波动影响：不能自动记录吸收光谱。国产721型、722型、751型、724型

0.575光源单色器吸收池检测器显示二.紫外-可见分光光度计仪器的类型2.双光束分光光度计斩光器优点：能自动记录吸收光谱（自动扫描）；自动消除光源强度变化引起的误差；是目前用得最多的分光光度计．光度计能自动比较两束光的强度，此比值即为试样的透射率，经对数变换将它转换成吸光度并作为波长的函数记录下来3.双波长分光光度计切光器将两束光以一定频率交替照射同一吸收池显示器显示两个波长吸光度差值适用于：多组分混合物、混浊试样(如生物组织液)分析，存在背景干扰或共存组分吸收干扰的情况下任务：掌握仪器的基本操作第四节紫外-可见分光光度法的应用

紫外-可见分光光度法可用于有机化合物的定性鉴定、结构推断和纯度检验。1.未知化合物的定性鉴定

定性依据：吸收光谱的形状、吸收峰位置、吸收峰的数目等。

方法：相同条件下，测定未知物和已知标准物的吸收光谱，对比图谱。

目前最常用的标准图谱：萨特勒标准图谱库一、定性分析一、定性分析与标准谱图对照1.未知化合物的鉴定与标准物质谱图对照最常用：萨特勒标准图谱共收集46000种化合物的紫外吸收光谱，查找方便2.有机化合物结构推断

有机物不少基团(生色团)，如羰基、苯环、硝基、共轭体系等，都有其特征的紫外或可见吸收带，某些特征基团的判别

在204nm附近有中强吸收带，在260nm附近有弱吸收带且有精细结构，是苯环的特征吸收

200-750nm无吸收峰，烷烃、饱和脂肪族3.化合物纯度检验化合物在紫外区没有明显的吸收峰，而杂质在紫外区有较强的吸收，就可以紫外吸收曲线检测出该化合物所含的杂质。如乙醇中杂质苯测定检查(实验三)二、定量分析定量分析可见分光光度定量分析紫外分光光度定量分析用于有色物质的测定用于有紫外吸收的物质的测定单组分的定量分析A.吸光系数法方法：已知待测组分吸光系数，测定溶液吸光度，代入朗伯-比尔定律公式计算含量。A=kbc

单组分的定量分析：只要求测定某一个样品中一种组分，且在选定的测量波长下，其他组分没有吸收即对该组分不干扰。定量分析方法例：以邻二氮菲光度法测定Fe(Ⅱ)，称取样品0.500g，经处理后，加入显色剂，最后定容为50.0mL。用1.0cm的吸收池，在510nm波长下测得吸光度A=0.430。计算样品中铁的质量分数。(ε510nm=1.1×104L·mol-1·cm-1)解：根据朗伯-比尔定律，A=kbc，则c=A/kb=0.430/(1.1×104×1)=3.91×10-5mol/L=2.19×10-6g/mL∴m(%)=2.19×10-6×50×100/0.500=0.0219B.标准对照法浓度已知标液Cs，在一定条件下测得吸光度As待测液Cx（浓度相近），在相同条件下测得吸光度为Ax

根据朗伯-比尔定律：

As=kbcsAx=kbcx

cx=（Ax/As）·cs

引起误差的偶然因素较多!

不可靠！！

C.标准曲线法方法：1.配制一系列不同浓度的标准溶液，以不含被测组分空白为参比溶液，测定标准系列溶液吸光度，以吸光度A为纵坐标，浓度C为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程A=a+bC。

2.在相同条件下测定样品溶液的吸光度，从上述标准曲线得出的回归方程计算出浓度。例题

以邻二氮菲为显色剂，采用标准曲线法测定微量Fe2+，实验得到标准溶液和样品的吸光度数据（见下表），试确定样品的浓度。溶液标准1标准2标准3标准4标准5标准6样品浓度C/(10-5mol·L-1）1.002.003.004.006.008.00Cx吸光度A0.1130.2120.3360.4340.6690.8680.712解：以吸光度A为纵坐标，浓度C为横坐标，绘制标准曲线，采用线性处理程序进行线性回归处理，得回归方程为：A=0.109×105C+0.0073,相关系数r2=0.9994标准曲线符合要求，将待测溶液吸光度代入回归方程，的试样浓度为:a，截距b，斜率相关系数，接近1线性好，>0.999Cx=(A-0.0073)/0.109×105

=(0.712-0.0073)/0.109×105

〓6.51×10-5mol·L-1在456nm处，用1cm比色皿测定锌，数据如下：C：2.004.006.008.0010.00A：0.1050.2050.3100.4150.515求：1.绘制吸收曲线

2.K3.A=0.260时C=？依据：吸光度具有加和性，同时测定两个或两个以上组分前提：绘制两种纯物质（x、y）的吸收光谱，三种情况2.多组分的定量分析

不重叠部分重叠相互重叠xyxyxy考核：

石灰石中微量铁的测定83第五节实验技术第一章紫外-可见分光光度法84内容概要一、样品的制备二、仪器测量条件的选择三、显色反应条件的选择85一、样品的制备

样品在溶液中测定，固体转换为溶液溶剂要求：1.对被测组分有良好的溶解能力

2.在测定波长范围内没有吸收3.无毒，不易挥发，价格便宜

86二、仪器测量条件的选择1.波长选择

选最大吸收波长λmax为测定波长

问题：如何绘制吸收曲线？选择原则：最强吸收带的最大吸收波长作为测量波长吸收峰太尖锐，可选用灵敏度低一些的波长测量，减少偏差87(1).手动绘制原则：先粗测再细测例：邻菲啰啉分光光度法测定铁含量最大吸收波长的选择

1.粗测：在440~560nm范围内，间隔20nm测一个点，绘制吸收曲线

选择500~520nm作为细测范围2.细测：在500~520nm范围内，间隔2nm测一个点，绘制吸收曲线510nm为最大吸收波长绘制吸收曲线的方法88(2).自动扫描法892.吸光度范围的选择光源不稳定、读数不准确、实验条件偶然变动测量误差实践证明，只有待测溶液吸光度A控制在适当范围内，仪器测量误差才比较小。选择A的测定范围为0.2～0.8相对误差

问题：如果测定吸光度过大或过小应如何处理？朗伯-比耳定律A=kbc

903.仪器狭缝宽度的选择原则：在不引起吸光度减小的情况下，选取最大的狭缝宽度。一般使用2nm缝宽！！91三、显色反应条件的选择1.显色剂及其用量的选择显色反应：将待测组分转化为有色物质显色剂：与待测组分形成有色物质的试剂a.显色剂的选择要求：（1）与待测离子显色反应的产物组成恒定、稳定性好、显色条件易于控制；

（2）产物有较强的吸收能力，即ε大；92

b.显色剂用量的选择固定被测组分浓度和其他条件，加入不同量的显色剂，分别测定吸光度A；

绘制吸光度A与显色剂用量CR的关系曲线：CRabab×√√932.反应的pH（显色反应的重要条件）同种金属离子与同种显色剂反应，生成的配合物配位数不同、颜色不同。如Fe3+与磺基水杨酸在不同pH条件下的配合物。pH对显色反应的影响：介质酸度解离程度显色反应完全程度94确定pH的方法：固定溶液中待测组分和显色剂浓度，改变溶液(缓冲溶液控制)的酸度(pH)绘制A～pH曲线，从中找出为pH范围。

ab平坦部分95小结5.pH值的选择1.测量波长的选择3.狭缝宽度的选择4.显色剂用量的选择2.吸光度范围的选择最大吸收波长A在0.2~0.8之间一般2nm缝宽曲线平坦部分曲线平坦部分96课后思考题

在