《DNA重组的载体》课件

DNA重组的载体什么是DNA重组？1基因工程DNA重组是基因工程的核心技术，指的是将不同来源的DNA片段连接在一起，形成新的重组DNA分子。2目标基因将目的基因插入到载体中，形成重组载体，再将重组载体导入宿主细胞，实现目的基因的复制、表达和功能研究。3新DNA分子通过DNA重组技术可以创造出新的基因型，改变生物体的性状，例如，将抗虫基因导入植物，培育抗虫作物。DNA重组的原理1识别和切割使用限制性内切酶识别并切割特定DNA序列，生成带有黏性末端的DNA片段。2连接通过DNA连接酶将带有相同黏性末端的DNA片段连接起来，形成重组DNA分子。3转入宿主细胞将重组DNA分子导入宿主细胞，例如细菌或酵母菌，使其复制和表达。DNA重组的目的和应用目的DNA重组技术允许科学家改变生物体的遗传物质，以改善其特征或创造具有新功能的生物体。应用DNA重组技术的应用广泛，包括药物开发，农业生产，环境保护等。载体的选择标准兼容性载体应该与宿主细胞兼容，能够在宿主细胞内复制和表达外源基因。大小载体的尺寸应适合于克隆的外源基因，同时要保持宿主细胞的转化效率。多克隆位点载体应该具有多个限制性内切酶位点，以便能够在特定位置插入外源基因。选择标记载体应该带有选择标记基因，用于筛选含有重组载体的宿主细胞。质粒载体质粒是细菌细胞中独立于细菌染色体之外的环状双链DNA分子，能在细菌细胞内复制，并能稳定地遗传下去。质粒载体是指经过改造，可以作为外源DNA片段的运载工具的质粒。质粒载体的结构质粒载体是环状的双链DNA分子，通常含有以下几个关键区域：复制起点（ori）：使质粒在宿主细胞中复制。选择标记基因（selectionmarker）：用于筛选含有质粒的细菌，通常是抗生素抗性基因。多克隆位点（MCS）：多个限制酶识别位点，用于插入外源DNA片段。启动子（promoter）：控制外源基因的表达。终止子（terminator）：终止外源基因的转录。质粒复制机制1自主复制质粒具有独立于宿主染色体的复制起点，可以自主复制。2复制方式质粒主要采用滚环复制或θ复制方式进行复制。3复制频率质粒复制频率与复制起点和复制起始蛋白有关。质粒选择标记质粒选择标记使我们能够识别和选择包含重组质粒的细菌。通过选择标记基因编码的抗性，仅携带质粒的细菌才能在含有抗生素的培养基中存活。常用的选择标记包括抗生素抗性基因，如氨苄青霉素抗性基因（AmpR）和卡那霉素抗性基因（KanR）。质粒与外源DNA的连接1限制性内切酶切割特定序列2连接酶连接DNA片段3载体运载外源DNA噬菌体载体噬菌体载体是利用噬菌体（病毒）的基因组作为载体，将外源DNA片段插入噬菌体基因组中，并利用噬菌体的感染和复制过程将外源DNA片段扩增和传播的一种基因克隆载体。噬菌体载体具有感染效率高、包装能力大、克隆容量大等优点，在基因克隆和基因表达中具有广泛的应用。噬菌体载体的结构特点噬菌体载体通常由头部、尾部和衣壳蛋白组成。头部包含噬菌体的遗传物质DNA或RNA，尾部用于吸附宿主细菌并注入遗传物质。噬菌体载体具有以下结构特点：拥有自己的复制起点，可以独立复制能够包装成病毒颗粒，易于传播载体容量较大，可以容纳较大的外源DNA片段噬菌体生活周期吸附噬菌体通过其尾部纤维特异性地吸附到宿主细菌表面的受体上。侵入噬菌体通过尾部鞘的收缩将自身的DNA注入宿主细菌体内。复制噬菌体的DNA进入宿主细菌后，利用宿主细胞的物质和能量进行复制，产生大量的子代噬菌体DNA和蛋白质。组装复制出来的噬菌体DNA和蛋白质组装成新的噬菌体颗粒。裂解新组装的噬菌体颗粒裂解宿主细菌，释放出来，感染新的宿主细菌。噬菌体DNA克隆策略1整合型将外源DNA整合到噬菌体基因组中2替换型用外源DNA替换噬菌体基因组的部分片段3附加型将外源DNA插入噬菌体基因组的非必需区域人工染色体载体酵母人工染色体(YAC)包含酵母染色体复制起始点，着丝粒和端粒，可容纳大型DNA片段细菌人工染色体(BAC)基于细菌F因子，适用于克隆大型基因组片段，稳定性高人工染色体的分类酵母人工染色体(YAC)用于真菌基因组研究，可克隆大片段DNA。细菌人工染色体(BAC)稳定遗传，适用于大型基因组的物理图谱构建。P1人工染色体(PAC)介于质粒和BAC之间，可克隆100-300kb的DNA片段。酵母人工染色体酵母细胞酵母是一种单细胞真菌，是基因工程中常用的宿主细胞。人工染色体酵母人工染色体(YAC)是一种基因工程载体，可以承载大片段外源DNA。细菌人工染色体细菌人工染色体（BAC）是一种人工构建的染色体载体，通常以大肠杆菌为宿主。BAC的结构类似于细菌的天然染色体，包含一个复制起点，一个选择标记，以及一个插入外源DNA片段的区域。BAC的大小通常为100-300kb，能够容纳较大的外源DNA片段，使其成为克隆和分析大型基因组片段的理想工具。人工染色体的优缺点优点可以克隆更大的DNA片段。适合克隆大型基因组，例如真核生物的基因组。优点可以进行基因表达调控。人工染色体可以整合到宿主细胞的基因组中，从而对基因表达进行调控。缺点构建过程比较复杂。需要进行大量的基因工程操作。缺点稳定性可能不如天然染色体。人工染色体在宿主细胞中可能不稳定，容易丢失。其他类型的载体病毒载体病毒载体具有较大的插入片段容量，可用于构建基因治疗载体，并能高效地将基因传递到宿主细胞。人工酵母染色体人工酵母染色体（YAC）可承载更大的DNA片段，适用于基因组克隆和基因表达研究。转座子载体转座子载体能随机插入宿主基因组，用于基因突变、基因插入和基因功能研究。大肠杆菌表达系统1高效大肠杆菌生长迅速，易于培养，并且能够高效地表达外源基因。2成本低大肠杆菌表达系统的构建和操作成本相对较低，适合大规模生产。3成熟大肠杆菌表达系统已经发展成熟，积累了丰富的经验和技术。酵母表达系统高效酵母表达系统效率高，可以产生大量的目标蛋白。易于操作酵母培养和操作相对简单，适合大规模生产。成本低酵母培养成本低，适合商业化生产。哺乳动物细胞表达系统蛋白质修饰哺乳动物细胞可以进行复杂蛋白质的翻译后修饰，如糖基化和磷酸化，这对于某些蛋白质的功能至关重要。人体相关性哺乳动物细胞表达系统更接近于人体环境，因此更适合研究人体蛋白质和药物。应用范围广泛应用于药物研发、疫苗生产、生物材料和诊断试剂等领域。选择合适的重组载体实验目的不同的载体适用于不同的实验目的，例如基因表达、基因敲除或基因沉默。宿主细胞类型载体应该与宿主细胞相容，确保外源基因能够在宿主细胞中表达和复制。载体类型质粒、噬菌体或人工染色体等载体类型应根据实验需求选择。外源基因的大小载体的容量应足够容纳外源基因，并保证其功能的完整性。载体的构建和测试1构建载体2连接外源DNA3转化宿主细胞4筛选和鉴定载体的扩增和保存1扩增在构建载体并测试其功能后，需要大量扩增载体以用于后续的基因克隆实验。2保存为了防止载体降解和污染，需要将载体保存在合适的条件下，例如低温保存。3方法常用的扩增方法包括细菌培养和质粒提取，保存方法包括低温冻存和干燥保存。载体的转化方法1化学转化法2电转化法3噬菌体介导转化化学转化法是利用化学试剂处理细菌，使其细胞壁暂时变得通透，从而使载体DNA进入细菌细胞。电转化法则是利用电脉冲短暂地改变细菌细