酶联免疫吸附试验课件

酶联免疫吸附试验

Enzyme-LinkedImmunosorbentAssays(ELISA)酶联免疫吸附试验免疫标记技术（immunolabellingtechnique）:

是指用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂或电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、定位分类：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术和发光免疫测定。酶联免疫吸附试验免疫酶测定法(EnzymeImmunoAssay,EIA)用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。

辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP)特点：高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值分类：酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体酶免疫组化法：组织中或细胞表面的抗原。酶联免疫吸附试验一、原理

酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种固相酶免疫测定的方法，目前广泛应用于各种抗原和抗体的检测。其基本原理是：将抗原或抗体固定在固相载体表面，并保持其免疫活性，再与酶标记抗体或抗原联结，并保持并保留酶的活性，然后加入酶反应的底物，后者被酶催化变为有色产物，反应颜色的深浅可与相应抗原或抗体的量相关。在本实验中，以辣根过氧化物酶标记抗人IgG抗体，与相应抗原IgG结合，标记的酶可催化底物（邻苯二胺）起显色反应，从而指示特异性抗原抗体反应的存在。酶联免疫吸附试验二、材料：1、人IgG包被的微量酶标反应板，（1：1万，1：2万，1：4万，1：8万，1：16万）2、酶标抗人IgG抗体稀释液、洗涤液（PH7.4，0.01MPBS-Tween20）、底物溶液，3、微量移液器、移液头、吸水纸、洗瓶、湿盒、37℃恒温箱等。酶联免疫吸附试验三、方法：1.人IgG包被微量酶标反应板：取人IgG各100ul，分别加入第1至5孔，设第6孔为对照。置37℃恒温箱2小时，取出，移入4℃冰箱过夜。取出，用洗涤液洗3次，5分钟/次。(略）2.用含小牛血清（BSA）的PH7.4PBS封闭，置37℃恒温箱，30分钟，取出。用洗涤液洗3次，3~5分钟/次。（略）3.用微量移液器吸取100ul酶标抗人IgG抗体，分别加入第6至1孔。置湿盒中，于37℃恒温箱中孵育30分钟。4.取出酶标板，用洗涤液洗3次，3~5分钟/次。5.按第6孔至第1孔的顺序，每孔各加100ul的底物溶液，置37℃恒温箱中10-15分钟。6.观察显色反应。酶联免疫吸附试验用PBS洗涤3次（将洗板液加入每孔，3min后倾去），以洗去未结合的游离酶标抗体。不同浓度IgG100ul/孔酶标板126543酶标抗人IgG抗体底物观察显色酶联免疫吸附试验四、结果1654321~5孔，随着包被抗原浓度降低，颜色逐渐变淡6孔（对照）无色五、结论

ELISA可简便、快速、定量地检测抗原或抗体酶联免疫吸附试验操作注意事项：1、正确掌握微量移液器的使用方法：一档取样，二档加样。2、正确洗涤酶标板：勿使洗涤液溢出，造成交叉污染洗涤后应尽量甩干孔内残液。3、注意加样顺序，加样品时应注意从最高稀释度逐一加至最低稀释度。4、底物OPD有一定致癌作用，故操作时应小心，勿使底物沾染实验台等器材。5，枪头（移液头）忌丢入实验台微生物专用的废液缸内。酶联免疫吸附试验ELISA的分类√直接法（CompetitiveELISA)：将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体检测液相中的可溶性抗原或抗体√间接法（IndirectELISA）：将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗检测液相中未知抗体√双抗体夹心法（SandwichELISA)：将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗检测液相中的可溶性抗原酶联免疫吸附试验SandwichELISAindirectELISA酶联免疫吸附试验ELISA检测抗原

Ag+Ab*↔Ag-Ab*酶联免疫吸附试验ELISA检测抗体

Ab+Ag*↔Ab-Ag*酶联免疫吸附试验ELISA检测抗体Ag+Ab1↔Ag-Ab1Ag-Ab1+Ab2*↔Ag-Ab1-Ab2*

酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验间接ELISA（可测多种细菌或病毒的抗体，用途广泛）显色

酶联免疫吸附试验免疫技术：以抗原-抗体反应原理为基础，对样品中相应抗原或抗体进行检测。标记技术：将可被探测的示踪物质用化学方法与化合物连接。标记免疫分析：用可微量或超微量检测的示踪剂标记抗原、抗体，检测免疫反应结果并确定待检物。免疫标记技术补充酶联免疫吸附试验放射免疫技术免疫荧光技术酶免疫技术三大经典标记技术三大经典标记技术酶联免疫吸附试验放射免疫RIA以标记抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合特异性抗体来测定待检样品中抗原量。

免疫放射IRMA以过量标记抗体与抗原非竞争结合，采用固相免疫吸附载体分离游离和结合标记抗体。放射受体分析RRA放射配体结合分析RBA其它放射免疫技术－原理酶联免疫吸附试验二、放射免疫技术－常用的放射性核素

125I

3H射线γβ理化性

活泼

差核素丰度

>90%－半衰期60.2d12.3y标记方法简单复杂标记设备低廉昂贵测量条件简单复杂常用标记核素酶联免疫吸附试验荧光抗体技术荧光免疫测定均相荧光免疫测定（homogeneousfluorescenceimmunoassay）

非均相荧光免疫测定（heterogeneousfluorescenceimmunoassay）荧光免疫技术荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光技术的敏感性相结合，对抗原或抗体进行定性、定位或定量检测。荧光免疫技术的类型酶联免疫吸附试验荧光抗体技术的基本原理

荧光素标记抗体与切片中组织细胞抗原反应，洗涤分离后荧光显微镜观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其部位，对组织细胞抗原进行定性和定位检测，或对自身抗体进行定性和滴度测定。酶联免疫吸附试验Immunofluorescence,IF酶联免疫吸附试验荧光显微镜

利用一定波长的激发光对样品进行激发，产生一定波长的荧光，对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。

酶联免疫吸附试验病原体检测寄生虫（猴胚肾细胞内弓形虫）细菌（藤黄微球菌)荧光抗体技术的应用酶联免疫吸附试验免疫病理检测肿瘤（人肝癌细胞）荧光抗体技术的应用酶联免疫吸附试验主要试剂:

酶标记的抗体或抗原酶标物特点：

免疫学活性酶对底物的催化活性抗原抗体反应的特异性+酶高效催化反应的专一性酶免疫测定法原理及特点酶联免疫吸附试验特点：灵敏度高、特异性强、准确性好酶标记试剂能够较长时间保持稳定操作简便、对环境没有污染。易与其它技术偶联衍生出适用范围更广的新方法。原理：酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应酶对底物的显色反应对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析

原理及特点酶联免疫吸附试验辣根过氧化物酶（HRP）

糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基）主酶与酶活性无关辅基是酶的活性中心RZ值：403nm（辅基）与275nm（主酶）OD值之比RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为重要ELISA中应用最为广泛的标记用酶常用酶酶和酶作用底物酶联免疫吸附试验酶免疫技术酶免疫组化酶免疫测定均相非均相固相酶免疫测定液相酶免疫测定组织切片或其它标本中抗原的定位

液体标本中抗原或抗体的定性和定量酶免疫技术的分类酶联免疫吸附试验碱性磷酸酶（AP）

菌源性AP肠粘膜AP

β–半乳糖苷酶（β-Gal）

用于均相酶免疫测定

常用酶酶和酶作用底物酶联免疫吸附试验HRP的底物

DH2+H2O2→→→D+2H2O

HRP供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种

H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高

常用底物酶和酶作用底物酶联免疫吸附试验HRP的常见底物

邻苯二胺OPD四甲基联苯胺TMB5-氨基水杨酸5-ASA2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐ABTS常用底物酶和酶作用底物酶联免疫吸附试验OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，致癌性。TMB反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。

HRP的常见底物

酶和酶作用底物酶联免疫吸附试验AP的底物

β-Gal的底物

对-硝基苯磷酸酯（pNPP）4-甲基伞酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405nm。

酶作用后，生成高强度荧光物，用荧光计测量。常用底物酶和酶作用底物酶联免疫吸附试验酶免疫技术的核心组成部分

酶结合物（conjugate）酶标记物通过化学反应或免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成的结合物

酶标记抗体或抗原酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验底物显色定性或定量的分析原理包被反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体洗涤使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离1234一、基本原理酶联免疫吸附试验固相的抗原或抗体

酶标记物（酶结合物）

酶反应的底物

三个必要试剂

二、方法类型及反应原理酶联免疫吸附试验双抗体夹心法方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色应用：

二价或二价以上的较大分子抗原测定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等ELISA检测抗原的方法酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验1、已知抗体包被于载体表面3、加酶标抗体与抗原结合4、加酶作用的底物产生颜色2、加待检物抗原与抗体结合4、加酶作用的底物不产生颜色洗涤洗涤洗涤洗涤双抗体夹心法测抗原1、已知抗体包被于载体表面2、加待检物无抗原与抗体结合3、加酶标抗体无抗原结合+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY酶联免疫吸附试验竞争法

方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。

应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）ELISA检测抗原的方法酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验洗涤洗涤竞争法测抗原+-YYYYYYEYYEYYYYEYYEYEYEYE2、加待检物抗原与酶标抗原竞争与抗体结合3、加酶作用的底物不显色或显色弱3、加酶作用的底物显色1、已知抗体包被于载体表面1、已知抗体包被于载体表面2、加待测物和酶标抗原，酶标抗原与抗体结合YE酶联免疫吸附试验间接法方法

用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。优点一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体应用

常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定ELISA检测抗体的方法酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验1、已知抗原吸附于载体表面2、加待检物无抗体与抗原结合3、加酶标抗Ig与抗体结合4、加酶作用的底物产生颜色1、已知抗体吸附于载体表面2、加待检物有抗体与抗原结合3、加酶标的抗Ig抗体4、加酶作用的底物不产生颜色洗涤洗涤洗涤洗涤间接法测抗体-YEYYYEYEYYYEYYEYYEYYEYYEYEY+酶联免疫吸附试验双抗原夹心法原理：类似双抗体夹心法操作步骤：类似应用：乙型肝炎表面抗体ELISA检测抗体的方法酶联免疫吸附试验竞争法原理：类似检测抗原的竞争法

应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测ELISA检测抗体的方法酶联免疫吸附试验捕获法

应用：

病原体急性感染诊断中的IgM型抗体

甲型肝炎HAV-IgM抗体

乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体ELISA检测抗体的方法酶联免疫吸附试验捕获法

原理：抗人IgMμ链抗体包被捕获待测标本中IgM类抗体加入特异性抗原和酶标记特异性抗原的抗体底物显色

酶联免疫吸附试验洗涤洗涤洗涤洗涤捕获法原理+-EYEYEYEYEYYYYYYY

1、固相化抗人

IgMYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY1、固相化抗人

IgM2、加待测物特异性IgM与非特异性IgM和抗人IgM结合3、加特异性抗原，与特异性抗体结合4、加酶标抗体与特异性抗原结合，加底物显色2、加待测物只有非特异性IgM和抗人IgM结合3、加特异性抗原，不能与非特异性IgM结合4、加酶标抗体无抗原结合，加底物不显色酶联免疫吸附试验人IL-2定量酶联检测

BAS-ELISA(生物素-亲和素ELISA)酶联免疫吸附试验

一、原理

ELISA(enzymelinkedimmunosorbentassay)是一种固相酶免疫测定的方法，广泛应用于各种抗原或抗体的微量检测，其基本原理是将已知抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原－抗体反应在固相表面进行，通过洗涤将固相上的抗原－抗体复合物与液相中的游离成分分离，再利用各种操作方法，测定可溶性抗原或抗体。

BAS-ELISA是在常规ELISA原理的基础上，结合生物素(B)与亲和素(A)间的高度放大作用，而建立的一种检测系统。亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，分子量为68kDa，由4个亚单位组成，对生物素有非常高的亲和力(结合常数高达1015M-1)。生物素很易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合。这样，结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。酶联免疫吸附试验本实验采用双抗体夹心ELISA法。抗人IL-2单抗包被于酶标板上，标准品中的IL-2会与单抗结合，游离的成分被洗去。加入生物素化的抗人IL-2抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。生物素和亲和素特异性结合；抗人IL-2抗体与结合在单抗上的人IL-2结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色剂，若反应孔中有IL-2，辣根过氧化物酶会使无色的显色剂现蓝色，加终止液变黄。在450nm处测OD值，IL-2浓度与OD450值之间呈正比，绘制标准曲线。酶联免疫吸附试验二、材料（人IL-2ELISA试剂盒）

1.1ng/ml人IL-2标准品2.标准品稀释液3.生物素化抗人IL-2抗体（1:100）4.酶结合亲和素（1:100）5.洗涤液6.显色剂（过氧化氢－四甲基联苯胺）7.终止液8.抗人IL-2单抗包被板条9.封板胶纸酶联免疫吸附试验三、操作步骤

1.包被抗体：用0.05MPH9.6碳酸盐缓冲液将已知抗体作适当稀释，在每个聚苯乙烯酶标板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜(18-24小时)。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。

2.配制不同浓度的标准品：

孔号12345678NS(ml)0.10.10.10.10.10.10.10.1

人IL-2(ml)0.10.10.10.10.10.10.10.1

稀释度1:21:41:81:161:321:641:1281:256酶联免疫吸附试验3.加样：将稀释的不同浓度的标准品各100ul加入反应孔1~8孔中，同时第9孔作空白孔。37℃孵育60分钟，洗涤4次，0.5分钟/次。

4.加B-Ab（生物素化抗IL-2