《干细胞体内近红外二区示踪成像操作规程》

ICS11.100

CCSC27

团体标准

T/XXXXX00XX—2023

干细胞体内近红外二区示踪成像操作规程

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（征求意见稿）

XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施

发布

T/XXXXXXXX—2023

干细胞体内近红外二区示踪成像操作规程

1范围

本文件确立了干细胞体内近红外二区示踪成像的操作程序，规定了操作中使用的试剂材料与仪器设

备，干细胞体内近红外二区示踪成像操作程序的构成，以及各步骤的操作指示和各步骤之间的转换条件，

描述了干细胞体内近红外二区示踪成像的追溯方法。

本文件适用于干细胞小鼠体内近红外二区示踪成像试验。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB19489—2008实验室生物安全通用要求

HJ421医疗废物专用包装袋、容器和警示标志标准

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4符号和缩略语

下列符号和缩略语适用于本文件。

CAS：美国化学文摘服务社（ChemicalAbstractsService）

CCK-8：细胞试剂（CellCountingKit-8）

DAPI：4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)

FLI：荧光成像（fluorescenceimaging）

FBS：胎牛血清（fetalcalfserum）

PBS：磷酸缓冲盐溶液（phosphatebufferedsaline）

PbS：硫化铅（leadsulfide）

Rnase—A：核糖核酸酶A(RibonucleaseA)

Sulfo—SMCC：4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐

（4-(N-Maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylicacid3-sulfo-N-hydroxysuccinimideester

sodiumsalt）

α-MEM：α最低必须培养基（alphaminimalessentialmedium）

5试剂材料与仪器设备

1

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5.1试剂材料

5.1.1除非另有说明，本试验所有试剂应符合制造商认证的细胞培养等级。其他试剂应选尽可能高的

纯度。

5.1.2本试验所用的水应为电阻率大于5MΩ•cm的纯水。其他试剂材料应符合表1的要求。

表1试剂材料清单

序号试剂材料名称用途浓度配比要求调配方法

1Ⅱ型胶原酶细胞培养0.03g/mlCASNo:9001-12-1

1000mg/LD-葡萄糖，

292mg/LL-谷氨酰胺，

2α—MEM培养基细胞培养/110mg/L丙酮酸钠，

2200mg/L碳酸氢钠，

pH值7.0～7.4

3胎牛血清细胞培养0.02g/ml

4青霉素（PNC）细胞培养100U/ml

5链霉素（SM）细胞培养100U/ml

6胰蛋白酶细胞培养2mg/ml

7地塞米松细胞培养0.1µmol/L

维生素C磷酸细胞培养50µmol/L

8

盐

9β--磷酸甘油细胞培养10mmol/L

3--异丁基--1--细胞培养0.5mmol/L

10

甲基黄嘌呤

11胰岛素细胞培养10µmol/L

12钙黄绿素细胞活性检测2µmmol/L

13碘化丙啶细胞周期测试8µmmol/L

14油红O染液染色5mg/ml

15硫代硫酸钠量子点合成10mmol/L

16醋酸铅Pb（ACO2）量子点合成10mmol/L

17硫化钠（Na2S）量子点合成10mmol/L

18氢氧化钠（NaOH）量子点合成1/6mol/L

19Rnase--A酶细胞标记50mg/ml

20穿膜肽Tat化学交联10mg/ml

21Sulfo--SMCC染色1mg

22DAPI染液稳定性试验5mg/ml

23酒精消毒75%医用酒精

24CCK--8试剂盒细胞增值能力测试/

碱性磷酸酶检测细胞成骨诱导分化测试/

25

试剂盒

26小鼠细胞提取与动物模型建立/近交系，6周龄以上

5.2仪器设备

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仪器设备的用途及要求应符合表2的规定。

表2仪器设备清单

序号仪器设备名称用途要求

1制冰机细胞试验雪花样冰

2自动酶标仪细胞试验200nm～1000nm全波长

3常温离心机量子点合成3000rpm/min

4电子天平量子点合成精度0.0001g

5脱色摇床细胞标记转速0rpm～240rpm，定时范围＞24h

6高压蒸汽灭菌器细胞培养、动物试验121℃，103.4kPa

7细胞培养箱细胞培养培养条件：37℃，CO25%

8流式细胞仪细胞试验荧光分辨率2%

9荧光倒置显微镜细胞试验配备汞灯

近红外荧光倒置显微镜细胞试验配备808nm激发光源、1250nm长通或1300nm带通滤

10

光片

环形聚焦单模微波合成系统量子点合成反应参数：70℃，30s

11

微波反应器

小动物近红外活体成像系统小动物活体成像配备808nm激发光源、1250nm长通或1300nm带通滤

12

光片

电感耦合等离子体发射光谱量子点理化特性测量波长：200nm～1500nm

13

仪

6干细胞体内近红外二区示踪成像程序的构成

干细胞体内近红外二区示踪成像程序包括间充质干细胞提取、间充质干细胞检验、近红外PbS量子

点的制备（以下简称“量子点制备”）、曝光观察、近红外PbS量子点标记间充质干细胞（以下简称“细

胞标记”）、近红外PbS量子点标记后间充质干细胞体外成像（以下简称“体外成像”）、近红外PbS

量子点与间充质干细胞的生物相容性测试（以下简称“生物相容性测试”）、近红外PbS量子点标记间

充质干细胞的稳定性和灵敏性（以下简称“稳定性和灵敏性测试”）、制作小鼠冈上肌腱撕裂模型（以

下简称“动物模型建立”）、活体成像10个阶段。程序流程图如图1所示。

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图1干细胞体内近红外二区示踪成像程序流程图

7干细胞体内近红外二区示踪成像

7.1间充质干细胞的提取

7.1.1近红外二区示踪成像体内观测使用的间充质干细胞可为商用间充质干细胞或自行提取的间充质

干细胞。

7.1.2自行从小鼠四肢长骨骨实质中提取间充质干细胞的操作方法如下：

a)取6周龄至8周龄的BALB/c小鼠，颈椎脱臼处死小鼠后，完全浸泡在75%酒精中消毒5min；

b)分离出小鼠肱骨、股骨和胫骨，去除长骨上的肌肉及其附着组织；

c)保留肱骨、股骨和胫骨的骨干，去除干骺端，用含有2%FBS的α—MEM培养基（以下简称培

养基）反复冲洗骨髓腔三遍以上去除造血干细胞；

33

d)冲洗后的骨干剪碎成1mm～3mm细小骨片，用3%的Ⅱ型胶原酶消化60min；

2

e)用含有2%FBS的α—MEM培养基反复冲洗细小骨片去除Ⅱ型胶原酶，然后将骨片种植到25cm

培养瓶中，加入间充质干细胞培养体系；

f)所有细胞在37℃，5%CO2和饱和湿度的恒温培养箱中培养。细胞生长至70%～80%汇合时，

0.25%胰酶消化传代。留取第三代细胞（P3）备用。

7.1.3只准许符合下列要求的间充质干细胞用于量子点标记。

a)为自然贴壁生长，形态为梭形，-80℃冷冻保存的细胞需复苏使用。

b)活力良好（95%以上），增值能力，分化能力（成脂、成骨）正常。

7.1.4提取的间充质干细胞若不满足7.1.3要求，应按7.1.2步骤重新提取或重新购买商用间充质干

细胞

7.2量子点的制备

近红外二区PbS量子点制备的操作方法如下：

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a)将500µl的10mmol/LPb(ACO2)2溶液加入10ml可微波试管中，随后加入50mg/mlRnase

—A溶液500µl，吹打混匀。再加入1/6mol/LNaOH溶液30µl～33µl（确保体系的pH在9～

11的范围内），吹打混匀，得到澄清的反应母液；

c)在反应母液中加入50µl的10mmol/LNa2S溶液后，放入功率为30W、动态模式（dynamic

model），温度为70℃的微波反应器中30s；

7.3曝光观察

7.3.1将合成的PbS量子点放入小动物近红外活体成像系统中，采用808nm激光光源激发，1100nm

长通滤光片，曝光时间为30ms观察样品荧光。

7.3.2当样品荧光在曝光时间小于30ms时达到过曝状态，即可进行细胞标记。

7.3.3若不满足7.3.2要求，应返回7.2重新进行PbS量子点制备。

7.4细胞标记

7.4.1进行PbS量子点标记间充质干细胞操作方法如下：

a)将1mg的Sulfo—SMCC和1mg的PbS量子点加入到1mlPBS缓冲液（PH7.4）中，使用脱

色摇床在室温下以小于等于60rpm的转速反应2h后，用常温离心机在室温下，3500rpm透

析离心10min，去除多余的Sulfo—SMCC；

b)PbS量子点与穿膜肽Tat以1:1000比例混合，使用脱色摇床在室温下以小于等于60rpm的转

速反应1.5h后，在4℃保存10h以上；

c)过夜后经3500rpm室温透析离心10min，去除多余的穿膜肽Tat；

d)收集P3间充质干细胞；

e)穿膜肽Tat连接的PbS量子点（10µg/ml）加入到间充质干细胞培养基中，37℃孵育12h；

f)弃去原培养基，PBS反复清洗细胞，去除未结合的PbS量子点，直至在清洗液中检测不到近红

外二区荧光信号。

g)细胞悬液在37℃，5%CO2和饱和湿度的恒温培养箱中继续培养细胞12h后方可进行体外成像。

7.4.2Pb(ACO2)2、Na2S和Rnase-A酶在微波作用下合成的PbS量子点，应在808nm激光光源激发和

1100nm长通滤光片的条件下发出明亮荧光，该荧光位于近红外二区波段（见图2）。

图2PbS量子点的白光和近红外二区荧光图像示意图

7.5体外成像

5

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7.5.1进行近红外二区PbS量子点标记后的间充质干细胞体外成像的操作方法如下：

a)吸去培养皿中的培养基，向PbS量子点标记的间充质干细胞中加入4%多聚甲醛，室温下固定

10min；

b)吸去多聚甲醛，用PBS反复清洗三遍去除剩余多聚甲醛，加入DAPI染色液，室温等待10min。

c)PBS反复清洗三遍，去除多余DAPI染色液，在配有近红外二区波段的荧光显微镜下观察细胞

质的荧光；

7.5.2被标记的间充质干细胞的白光、近红外二区荧光、DAPI荧光和叠加的显微图像参见图3，标尺

为20µm。

图3被标记的间充质干细胞的显微图像示意图

7.5.3只准许在细胞质中观察到均匀的近红外二区荧光信号才能进行生物相容性测试，否则按7.4重

新进行细胞标记。

7.6生物相容性测试

7.6.1按照7.4至7.5的方法分别用0与10µg/ml的PbS量子点标记间充质干细胞后，应按以下步

骤进行近红外二区PbS量子点与间充质干细胞的生物相容性测试。

a)细胞活力测试：

1)吸去培养基，PBS清洗3次贴壁间充质干细胞，去除多余培养基；

2)向培养皿加入2µmmol/l的钙黄绿素和8µmmol/l的碘化丙啶。染液没过单层细胞，37℃

孵育30min；

3)PBS反复清洗三遍，荧光显微镜下观察间充质干细胞，记录活细胞比例，绿染为活细胞，

红染为死细胞。

b)细胞增殖能力测试：

3

1)在24孔板中接种间充质干细胞悬液（2×10/孔），按培养基与CCK-8溶液10:1的比例，

将CCK—8溶液加入至24孔板中。

2)将24孔板在细胞培养箱中孵育2h，测定细胞在450nm处的吸光度。在PbS量子点标记

细胞后的第1d、3d、5d、7d、9d、11d、15d和17d重复b)操作以观察标记后不

同时间点的细胞增殖能力。

c)细胞周期测试：

6

1)在PbS量子点标记细胞后的第2d收集细胞悬液，至少5×10个细胞；

2)将收集的细胞固定在冰浴预冷的70%乙醇中，在4℃的温度下保存10h以上；

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3)1000g离心3min，沉淀间充质干细胞，小心吸出上清，PBS清洗间充质干细胞两次；

4)每管细胞样品中加入0.5ml碘化丙啶染色液，重悬细胞沉淀，避光温浴30min后，用流

式细胞仪检测细胞周期。

d)细胞自我更新能力测试：

2

1)将PbS量子点标记的细胞用间充质干细胞培养基稀释，按照10个细胞/cm的密度接种在

六孔板；

2)接种14d后，PBS清洗贴壁细胞，4%多聚甲醛室温固定10min；

3)蒸馏水清洗5次，结晶紫染液室温染色15min，PBS清洗细胞两次，计数每组的细胞集落

数目。

e)油红染色细胞成脂诱导分化测试：

1)收集不同浓度的PbS量子点标记的间充质干细胞，添加成脂诱导体系；

2)在诱导培养第14d，PBS清清洗贴壁细胞，加入洗贴壁细胞，加入0.5%的油红染液，避

光孵育20min；

3)吸出染液，PBS反复清洗细胞；

4)显微镜下拍照。

f)碱性磷酸酶染色细胞成骨诱导分化测试：

1)收集不同浓度的PbS量子点标记的间充质干细胞，添加成骨诱导体系；

2)在诱导培养第14d，PBS清洗贴壁细胞，4%多聚甲醛室温固定10min；

3)吸出固定液，滴加配置好的碱性磷酸酶孵育液，避光孵育20min；

4)吸出染液，PBS反复清洗细胞，显微镜下拍照。

7.6.2进入稳定性和灵敏性检测的PbS量子点标记的间充质干细胞，应符合下例条件：

a)细胞活力、增值能力、周期、自我更新能力测试与对照组之间没有明显差异；

b)油红染色显示各组细胞出现大量脂滴，脂滴连接成环状，脂环大小与对照组之间没有明显差异；

c)各组细胞碱性磷酸酶染色均为阳性，着色率与对照组之间没有明显差异。

7.6.37.6.2中a）、b）、c）各项中描述的细胞指标与对照组之间的比较应按以下步骤进行：

a)将近红外二区量子点标记后的细胞各项参数与未标记的对照组细胞各项参数用T检

验和秩和检验进行比较，包括活力，增值能力，分化能力等。

b)当计量资料符合正态分布时，用均数±标准差表示，否则用中位数表示；计数资料用百分数表

示。多组计量资料之间的两两比较采用T检验。计数资料的总体分布未知时，采用秩和检验。

采用统计产品与服务解决方案（SPSS）23.0软件进行统计学分析，当P＜0.05时，差异具有

统计学意义。

c)若SPSS软件测定出P＞0.05，则表明标记后细胞性能未受影响，可进行体内成像试验；若P

≤0.05，则需重新测量，最多进行3次测量，若3次测量P均小于等于0.05，则返回7.5重

做。

7.6.4按7.6.3比较后，细胞指标若不满足7.6.2各项要求，则重新进行7.6.1各步骤。7.6.1的试

验最多重复进行三次，若三次都不满足7.6.2要求，则应返回到7.5重新进行体外成像。

7.7稳定性和灵敏性测试

7.7.1PbS量子点标记的间充质干细胞体外稳定性测试应按以下步骤进行：

a)在细胞迁移小室（transwell）上室与下室之间隔一层孔径8µm，仅允许PbS量子点穿过，间

充质干细胞不能通过的多孔滤膜；

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b)将PbS量子点标记的1×10间充质干细胞接种在transwell上室，未标记的1×10间充质干

细胞接种在transwell下室；

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c)接种后的第1d、3d、5d、7d收集细胞，并按7.5.1步骤进行DAPI染色与成像：

7.7.2PbS量子点标记的间充质干细胞体内灵敏度和稳定性测试应按以下步骤进行：

33345

a)PbS量子点标记的不同数量的间充质干细胞（1×10、2×10、5×10、2×10和2×10）皮下

移植在裸鼠背部；

b)在移植后的第1d、7d、14d、21d和28d对裸鼠进行近红外二区活体成像，采用808nm

激光光源激发，1100nm长通滤光片，曝光时间为100ms，观察各组细胞荧光情况；

c)用ImageJ软件测定荧光强度，评估移植后第1天细胞数量与近红外二区荧光强度的相关性。

7.7.3只准许体外细胞标记稳定性良好，下室未观察到荧光信号，体内成像灵敏度达1×103个细胞，

且至少7天稳定成像后方可进行活体成像。

7.7.4PbS量子点标记的间充质干细胞若不满足7.7.3的要求，则从7.7重新开始测试，若重新测试

三次仍不能满足7.7.3的要求，则返回7.4。

7.8动物模型建立

7.8.1制备小鼠冈上肌腱撕裂动物模型步骤如下：

a)麻醉小鼠后，用碘伏消毒手术侧整个前肢；

b)在小鼠肩关节外侧行一个约10mm的横形切口，暴露三角肌；

c)根据肌肉上的血管辨认肌肉边缘（参见图4）；

d)切开三角肌，外展外旋肩关节，暴露冈上肌（参见图5）；

图4三角肌肌肉边界示意图

图5冈上肌示意图

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e)辨认冈上肌腱，用5-0缝线游离冈上肌（参见图6）；

图65-0Prolene缝线游离冈上肌示意图

f)8-0缝线对冈上肌腱进行改良编织缝合（参见图7）；