《肝素酶活性的测定》编制说明

《肝素酶活性的测定分光光度法》中国生化制药工业协

会团体标准编制说明

一、工作简况

（一）任务来源

肝素酶可以催化肝素或者硫酸乙酰肝素的裂解反应，分为肝素酶

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，其最重要的用途之一是酶解肝素制备低分子量肝素，而

低分子量肝素是最重要的抗凝血药物之一。肝素酶的酶活性是其质量

的重要指标之一，鉴于目前我国并无统一的肝素酶活性测定的方法标

准，产品的实际酶活性和包装标识的酶活性是否一致还缺乏相关的标

准进行规范约束和验证，因此研制肝素酶活性的测定标准将为肝素酶

的生产、流通及监管提供依据，促进我国肝素行业以及肝素酶相关医

药行业的健康发展，具有非常重要的现实意义。根据行业的现实需求，

清华大学、中国标准化研究院、清华大学深圳国际研究生院、北京碧

澄生物科技有限公司、深圳湾实验室、苏州大学于2021年8月联合提

出《肝素酶活性的测定分光光度法》团体标准计划，并确定由清华

大学牵头承担标准起草任务。

2022年2月，经中国生化制药工业协会组织专家通过批准立项，

立项名称为《肝素酶活性的测定分光光度法》。

（二）标准的起草单位及起草人

本标准起草单位：清华大学、中国标准化研究院、清华大学深圳

国际研究生院、北京碧澄生物科技有限公司、深圳湾实验室、苏州大

学。

本标准主要起草人：王怡、苏楠、吴希、邢新会、张翀、徐冰、

云振宇、吴琦、赵琳、张真庆。

（三）主要工作过程

1.预阶段

2021年8月至2022年1月，标准起草单位组织相关技术人员对《肝

素酶活性的测定分光光度法》标准项目进行了预研，对肝素酶Ⅰ、

Ⅱ、Ⅲ的活性测定条件进行了摸索，初步确立了肝素酶活性的测定方

法。标准起草组向中国生化制药工业协会提交了标准建议书与标准草

案，进行申报立项。

2.立项阶段

2022年2月，中国生化制药工业协会正式通过本团体标准的立项。

3.起草阶段

针对该标准项目，正式成立了标准起草工作小组，明确了任务要

求，安排了工作进度，根据单位参与的人员的专业、技能、人数将任

务合理分配。依据GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准

化文件的结构和起草规则》对标准草案进一步完善的同时，开展技术

指标的实验验证工作。

在此期间，严格遵守国家新型冠状病毒感染肺炎疫情防治工作的

要求，通过电话会议形式开展了5次工作会议。会议就标准制定的相

关问题进行了协商与研究，并对标准的框架及内容进行了认真研究和

讨论。由此形成了最终的《肝素酶活性的测定分光光度法》团体标

准征求意见稿和编制说明。

二、确定标准主要技术内容

（一）标准编制原则

坚持严要求、适宜性与可操作性相结合的原则。严要求即标准的

编制严格遵循GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文

件的结构和起草规则》及相关法规的要求进行；适宜性既要充分考虑

到本行业的发展现状与特点，又要有一个适宜的范围与程度,从而提

高标准贯彻实施的可操作性。

（二）本标准主要技术内容

1.主体内容

本标准的主体内容包括：范围、规范性引用文件、术语和定义、

原理、试剂、仪器设备、试样制备和试验步骤、试验数据处理、精密

度以及试验报告。

2.范围

本文件描述了测定肝素酶活性的分光光度法。本文件适用于生化

试剂、工业酶制剂中肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ活性的测定。

3.规范性引用文件

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。

4.术语和定义

对肝素酶活性单位进行了定义，是在30℃、pH7.0的条件下，每

分钟产生1μmol4,5-不饱和糖醛酸所需的酶量。一个酶活性单位以U

表示。

5.原理

肝素酶催化底物肝素或硫酸乙酰肝素裂解会生成4,5不饱和糖醛

酸。4,5不饱和糖醛酸在232nm波长下有特征吸收（图1），通过监测

232nm下的吸光度的变化来测定4,5不饱和糖醛酸的生成速率，计算

酶活性。

图1肝素酶催化生成的4,5不饱和糖醛酸的全波长扫描图

6.肝素酶酶活性测定方法的确立

由于酶的活性会受到温度、pH以及离子添加剂等多种参数的影

响，因此选取不同温度、不同pH、不同CaCl2浓度条件对肝素酶Ⅰ、

Ⅱ、Ⅲ的活性进行测定，以确定酶的活性测定方法中的各项重要参数。

此外，反应时间也会影响酶活性测定的结果，因此该参数也需在方法

中确立。

6.1反应温度的确定

肝素酶等酶的催化作用受温度的影响很大，一方面提高温度可以

增加酶促反应的速度，另一方面酶的化学本质是蛋白质，温度过高可

引起蛋白质变性，导致酶的失活。

不同温度对肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ活性的影响如图2所示。肝素酶Ⅰ

和肝素酶Ⅱ的最适催化温度为30℃，而肝素酶Ⅲ的活性在20℃-40℃

的范围内随温度提高而缓慢提高，综合考虑三种肝素酶的热稳定性，

在标准文本中确定选取30℃为肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的活性测定温度。

图2肝素酶的酶活性随温度的变化

6.2反应pH的确定

反应体系pH值对于肝素酶等酶的活性影响很大，pH的改变能影

响酶活性中心上必须基团的解离程度，同时也能影响底物的解离程度，

从而影响酶分子对底物分子的结合和催化。而当pH过小（过酸）或者

过大（过碱）都有可能使蛋白变性而失活。

不同pH对肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ活性的影响如图3所示。肝素酶I和Ⅲ

均能在pH6.0-7.0的范围内保持较高的活性，而肝素酶Ⅱ的最适pH为

7.0，三种肝素酶在pH为9.0的条件下迅速失活。对于三种肝素酶，选

取pH7.0为活性测定的pH。

图3肝素酶的酶活性随pH的变化

6.3离子添加剂CaCl2浓度的确立

前期研究表明钙离子是肝素酶活性所必需的辅助因子。CaCl2浓

度对三种肝素酶的活性影响如图4所示，其中三种肝素酶在CaCl2浓度

为0时的活性分别设为100%。CaCl2的加入使得三种肝素酶的活性均

有所提高，在CaCl2浓度为1.2-5.0mM的范围内，钙离子的浓度对三种

肝素酶的酶活性影响不大，因此在标准文本中选取1.2mM为肝素酶

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ活性测定时的CaCl2浓度。

图4肝素酶的酶活性随CaCl2浓度的变化

6.4反应时间的确立

肝素酶活性测定过程中吸光度随时间的变化曲线如图5所示。为

保证酶活性测定的准确性，并且不遗漏活性测定过程中的重要数据，

活性测定时间为20min，在此时间范围内，三种肝素酶催化生成的底

物吸光度呈线性增加的趋势。应选取曲线平滑且线性的60s区段，通

过线性回归方程计算斜率从而计算酶活性。

图5肝素酶活性测定过程中的吸光度变化

7.试剂

本标准给出了肝素酶活性的测定方法中所使用的试剂的清单，包

括肝素钠、硫酸乙酰肝素、盐酸溶液、肝素酶Ⅰ及肝素酶Ⅱ的反应底

物溶液以及肝素酶Ⅲ的反应底物溶液。描述了试剂的主要特性，并给

出了溶液的制备方法。

对于肝素酶Ⅰ和Ⅱ活性的测定，底物溶液含20mmol/L三羟基甲

基氨基甲烷（Tris）、1.2mmol/L氯化钙（CaCl2）、150mmol/L氯化

钠（NaCl）及8.3g/L肝素钠，pH7.0；对于肝素酶Ⅲ活性的测定，底

物溶液含20mmol/LTris、1.2mmol/LCaCl2、150mmol/LNaCl及16.7

g/L硫酸乙酰肝素，pH7.0。

8.仪器设备

本标准给出了肝素酶活性的测定方法中所使用的仪器设备的清

单，并描述了主要特性。仪器设备包括分析天平、pH计、紫外-可见

分光光度计、恒温水浴槽、磁力搅拌器、石英比色皿、容量瓶、烧杯、

量筒以及移液器。

9.试样制备和试验步骤

由于市售的肝素酶包含液体样品和固体样品两种形态，因此在试

样酶液的制备中分为液体样品待测酶液制备和固体样品待测酶液制

备两部分。

酶活性的测定步骤为：准确移取1mL反应底物溶液于石英比色皿

中，置于分光光度计的保温槽内，待温度稳定于30℃后，迅速加入10

μL待测酶液，加盖颠倒混匀后立即放入分光光度计，在232nm下扫描

20min，保存吸光度曲线。选取曲线平滑且线性的60s区段，通过线

性回归方程计算斜率。

10.试验数据处理

分为液体样品和固体样品两部分。

10.1液体样品

试样中肝素酶活性按式（1）计算：

()××

=························(1)

×

𝑉𝑉1+𝑉𝑉2𝑘𝑘𝐷𝐷

𝑋𝑋1𝜀𝜀𝑉𝑉2

式中：

X1——肝素酶活性，单位为酶活性单位每毫升（U/mL）

V1——反应底物溶液的体积，单位为微升（μL）；

V2——酶活性测定中加入酶液的体积，单位为微升（μL）；

k——酶活性测定中吸光度曲线斜率，单位为吸光度每分钟

（Abs/min）；

D——稀释倍数；

ε——吸光系数，单位为mM-1cm-1（取值为3.8mM-1cm-1）。

计算结果保留三位有效数字。

10.2固体样品

试样中肝素酶活性按式（2）计算：

()×

=×·······················(2)

×

𝑉𝑉1+𝑉𝑉2𝑘𝑘𝑉𝑉0

式中：𝑋𝑋2𝜀𝜀𝑉𝑉2m

X2——肝素酶活性，单位为酶活性单位每克（U/g）

V1——反应底物溶液的体积，单位为微升（μL）；

V2——酶活性测定中加入酶液的体积，单位为微升（μL）；

k——酶活性测定中吸光度曲线斜率，单位为吸光度每分钟

（Abs/min）；

ε——吸光系数，单位为mM-1cm-1（取值为3.8mM-1cm-1）；

V0——溶解酶粉的液体体积，单位为毫升（mL）；

m——称取酶粉的质量，质量为克（g）。

计算结果保留三位有效数字。

11.精密度

取同一样品，相同条件下连续测定3次，结果如表1所示。肝素

酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的酶活性的RSD分别为0.53%、2.2%与1.8%，说明重

复性好。基于以上重复性结果，在标准文本中规定了精密度为：在

重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算数平均

值10%。

表1重复性条件下的酶活性测定数据

酶酶活性1酶活性2酶活性3平均酶活性RSD

（U/mL）（U/mL）（U/mL）（U/mL）

肝素酶Ⅰ10.810.910.910.90.53%

肝素酶Ⅱ11.011.010.610.92.2%

肝素酶Ⅲ10.911.311.111.11.8%

12.试验报告

试验报告应包括下列内容：a)试样本身必要的详细说明；b)本

文件的编号；c)分析结果；d)测定过程中存在的任何异常情况；e)

试验日期、试验报告出具日期、实验室名称和地址。

（三）本标准制定参考的主要依据

本标准制定过程中参考了以下相关标准：GB/T33409-2016《β-半

乳糖苷酶活性检测方法分光光度法》、GB/T34222-2017《核糖核酸

酶活力检测方法》、GB/T35538-2017《工业酶制剂测定技术导则》。

三、主要试验（验证）的分析、综述报告，技术经济论证，预期

的经济效果；

（一）主要试验（验证）的分析

1.起草组依据标准草案中拟定的肝素酶活性检测方法开展了验

证实验。收集了市场上三个不同厂家的肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ、肝素酶

Ⅲ，按照本标准的方法对其酶活性进行了测定，所得结果如表2所示。

结果表明，所有的肝素酶均能测出活性，且测得酶活性与标称酶活性

的比例均在60%以上，表明该方法具有较强的适用性。而由于不同厂

家检测条件不同，各厂家生产的肝素酶的酶学特性存在差异，因此标

识与本标准检测结果也会存在差异。这也进一步说明建立统一的肝素

酶活性测定方法具有重要意义。

表2.不同厂家的三种肝素酶的活性测定

测得酶活性标

标称酶活性测得酶活性/

酶厂家称酶活性

（U/mL）（U/mL）

（%）

肝素酶Ⅰa10.011.7117

肝素酶Ⅰb0.832.0241

肝素酶Ⅰc10.07.575

肝素酶Ⅱa15.014.798

肝素酶Ⅱb0.1670.1166

肝素酶Ⅱc15.011.979

肝素酶Ⅲa11.0