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DB41DB41/T1589—2018饲料中单核细胞增生李斯特氏菌的检测EMA-PCR法2018-04-17发布2018-07-17实施河南省质量技术监督局发布I1GB4789.30食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞4.32×PremixTaq缓冲液：内含TaqDNA聚合酶1.25a）上游引物：5＇-GATGACGAAATGGCTTACAGTGAAT-3';4.10叠氮溴化乙锭（EMA，0.2mg/mL见附录A的A.4。4.11溴化乙锭（10mg/mL）。4.12灭菌离心管：1.5mL，15mL。25.4离心机：转速≥12000r/min。取25g试样于225mL李氏增菌肉汤LB1（4.2）中，充分混匀，30℃±1℃培养24h±2h。取0.1mL预取1mL增菌液至离心管中，12000r/min离心2min，弃上清。加入1mL灭菌水悬浮沉淀物，12000r/min离心2min，弃上清，重复洗涤一次。加适量灭菌水悬浮沉淀物并调节菌悬液浓度至0.5麦将离心管开盖置于冰上，卤素灯照射下曝光1min，然后水浴煮沸15min，再将离心管转移至冰浴中使其快速冷却15min。涡旋混匀裂解物，12000r/min离心2min，收集上清称取1.5g琼脂糖（4.5）加入100mL1×TAE电泳缓冲液（4.8）中，加热使其充分熔化，冷至65℃3泳20min～30min。如果单核细胞增生李斯特氏菌阳性对照的PCR产物在271bp处出现条带（参见附录B），照PCR产物于271bp处未出现条带，则检测结果成立；否样品的PCR产物电泳后在271bp处出现条带，则为疑似阳性样品，此时需按GB4789.30进行确证，样品的PCR产物电泳后在271bp处未出现条带，判定25g样品中未检出单核细胞增生李斯特氏菌。4培养基和试剂A.1.1成分胰胨5.0g多价胨5.0g酵母膏5.0g氯化钠20.0g磷酸二氢钾1.4g磷酸氢二钠12.0g七叶苷1.0g水1000mLA.1.2制法A.1.2.1李氏增菌肉汤LB1每221%萘啶酮酸（用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制）0.5mL0.3mLA.1.2.2李氏增菌肉汤LB2每201%萘啶酮酸0.4mL0.5mLA.2.1成分242.0g37.2g57.1mL942.9mLA.2.2制法调节至pH8.3，定容至1L后，室温保存。使用时稀释50倍即为5A.3.1成分0.5mol/L乙二胺四乙酸（EDTA，pH8.0）0.5g0.5g0.06mL360mL640mLA.3.2制法0.5mol/LEDTA（pH8.0）溶于500mL灭菌水中，加入溴酚蓝和二甲苯氰FF溶解，与甘油混合，定容至1000mL，分装后4℃保存。A.4.1成分叠氮溴化乙锭5mg灭菌水25mLA.4.2制法5mg叠氮溴化乙锭溶于5mL灭菌水中，定容至25mL，充分混匀，分装后-20℃避光保存。6(资料性附录)单核细胞增生

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