《动物检疫核酸标准物质生产者技术规范》

ICS03.120.20

CCSA00

RB

中华人民共和国认证认可行业标准

RB/TXXXXX—XXXX

动物检疫核酸标准物质生产者技术规范

Technicalspecificationforreferencematerialproducersofnucleicacidofanimal

quarantine

（征求意见稿）

XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施

国家认证认可监督管理委员会发布

XX/TXXXXX—XXXX

动物检疫核酸标准物质生产者技术规范

1范围

本文件规定了动物检疫核酸标准物质生产者的结构要求，资源要求，技术和生产要求，标准物质候

选物的要求，标准物质的制备、溯源性分析、均匀性检验、稳定性检验、定值，标准物质的文件和标签，

标准物质的包装与运输，标准物质的储存，标准物质的管理等。

本文件适用于动物检疫核酸标准物质的生产。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T15000.2标准样品工作导则第2部分：常用术语及定义

GB/T15000.3标准样品定值的一般原则和统计方法

GB/T15000.4标准样品工作导则第4部分：证书、标签和附带文件的内容

GB/T15000.7标准样品工作导则第7部分：标准样品生产者能力的通用要求

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27420合格评定生物样本测量不确定度评定与表示应用指南

JJF1005标准物质通用术语和定义

JJF1265生物计量术语及定义

3术语和定义

GB/T15000.2，JJF1005，JJF1265界定的以及下列术语和定义适用于本文件。

3.1

标准物质referencematerial；RM

标准样品referencematerial；RM

具有一种或多种规定特性足够均匀且稳定的材料，已被确定其符合测量过程的预期用途。

[来源：GB/T15000.2-2019，2.1.1]

3.2

有证标准物质certifiedreferencematerial；CRM

有证标准样品certifiedreferencematerial；CRM

4

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采用计量学上有效程序测定的一种或多种规定特性的标准样品，并附有证书提供规定特性值及其不

确定度和计量溯源性的陈述。

[来源：GB/T15000.2-2019，2.1.2]

3.3

标准物质候选物candidatereferencematerial

候选标准样品candidatereferencematerial

拟作为标准样品生产的材料。

[来源：GB/T15000.2-2019，2.1.3]

3.4

最小样本量minimumsamplesize

最小取样量minimumsampleintake

标准样品在测量过程中的用量下限，通常用质量表示。该取样量可确保标准样品文件中所描述的值

或属性有效。

[来源：GB/T15000.2-2019，2.1.8]

3.5

定值characterization

（标准样品的定值）标准样品特性值或特性属性的测定，是生产过程的一部分。

[来源：GB/T15000.2-2019，2.1.10]

3.6

均匀性homogeneity

标准样品中特定部分的某个规定特性值的一致性。

[来源：GB/T15000.2-2019，2.1.12]

3.7

稳定性stability

标准样品在规定条件下贮存时的特性，其某个规定特性值在规定时间内保持在规定限值范围内。

[来源：GB/T15000.2-2019，2.1.15]

3.8

运输稳定性transportationstability

标准样品在运输条件下送达用户时间内特性的稳定性。

[来源：GB/T15000.2-2019，2.1.16]

3.9

长期稳定性long-termstability

5

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在长时间内标准样品特性的稳定性。

[来源：GB/T15000.2-2019，2.1.17]

3.10

有效期periodofvalidity

（标准样品的有效期）标准样品生产者保证标准样品稳定的时间区间。

[来源：GB/T15000.2-2019，2.1.19]

3.11

特性值propertyvalue

（标准样品的特性值）表示标准样品的物理、化学或生物所对应特性量的值。

[来源：GB/T15000.2-2019，2.2.1]

3.12

认定值certifiedvalue

标准值certifiedvalue

赋予标准样品特性的值，其具有不确定度和计量溯源性陈述，并在标准样品证书中标明。

[来源：GB/T15000.2-2019，2.2.3]

3.13

计量溯源性metrologicaltraceability

通过具备证明文件的不间断的校准链，将测量结果与参照对象联系起来的测量结果的特性，校准链

中的每项校准都会引入测量不确定度。

[来源：JJF1005-2016，4.9]

3.14

标准物质证书referencematerialcertificate

标准样品证书referencematerialcertificate

包含使用有证标准物质的基本信息，确认已采用必要的程序保证所述特性值有效性和计量溯源性的

文件。

[来源：GB/T15000.2-2019，2.3.2]

3.15

标准物质生产者referencematerialproducer；RMP

标准样品生产者referencematerialproducer；RMP

技术上有能力的机构（组织或公司、公立或私营），对其标准样品生产的项目策划和管理、特性值

及其不确定度的赋予和确定、特性值的批准、标准样品证书或其他文件发布负全部责任。

[来源：GB/T15000.2-2019，2.3.5]

6

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3.16

生产production

（标准样品的生产）为发布和维护（有证或非有证）标准样品开展的所有必要活动和任务。

[来源：GB/T15000.2-2019，2.3.7]

3.17

质粒plasmid

细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子,能稳定地独立存在于染色体外,并传递到子代,一般

不整合到宿主染色体上。

[来源：JJF1265-2010，4.28]

3.18

脱氧核糖核酸deoxyribonucleicacid（DNA）

一类带有遗传信息的生物大分子。有四种主要的脱氧核苷酸(脱氧单磷酸腺苷dAMP、脱氧单磷酸鸟

嘌呤dGMP、脱氧单磷酸胞嘧啶dCMP和脱氧单磷酸胸腺嘧啶dTMP)通过3′,5′-磷酸二酯键连接而成。它

们的组成和排列不同,显示出不同的生物功能,如编码功能、复制和转录的调控功能等。排列的变异可能

产生一系列疾病。

[来源：JJF1265-2010，4.30]

3.19

核糖核酸ribonucleicacid（RNA）

核酸的一类。由核苷酸通过3′,5′-磷酸二酯键连接而成的多聚体。不同种类的RNA链长不同,行使

各式各样的生物功能,如参加与蛋白质生物合成的RNA有信使RNA、转移RNA和核糖体RNA;与转录后加工

有关的RNA有核小RNA、核仁小RNA;与生物调控有关的RNA有微RNA、干扰小RNA等。

[来源：JJF1265-2010，4.32]

3.20

核酸nucleicacid

由核苷酸或脱氧核苷酸通过3，，5，-磷酸二酯键连接而成的一类生物大分子。具有非常重要的生物

功能，主要是贮存遗传信息和传递遗传信息。包括核糖核酸（RNA）和脱氧核糖核酸（DNA）两类。

[来源：JJF1265-2010，4.42]

3.21

聚合酶链式反应polymerasechainreaction（PCR）

聚合酶链反应是一种对特定DNA片段在体外进行快速扩增的方法,由变性—退火—延伸三个基本反

应步骤构成。

[来源：JJF1265-2010，5.15]

4结构要求

7

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4.1标准物质生产者应符合GB/T15000.7规定的标准物质生产者能力的通用要求，应具有明确的法律

地位，建立完备的质量管理体系。

4.2标准物质生产者应具备GB/T15000.7要求的生产者能力，具备标准物质生产所必需的工作场所、

仪器设备、专业人员及管理等条件。

4.3从事动物检疫核酸标准物质生产的场所，应符合GB19489的规定，应依据病原微生物的危害级别

进行安全控制，防止病原微生物扩散，避免在样品制备过程中对环境造成影响。

5资源要求

5.1人员

5.1.1标准物质生产者应制定保密信息管理政策和程序，并确保所有涉及标准物质生产的人员遵守该

程序。

5.1.2标准物质生产者应制定人员教育、培训、监督、授权的政策和程序，并按照程序的规定对人员

进行管理。

5.1.3动物检疫核酸标准物质生产者应确保所有依据管理体系要求从事标准物质生产的人员（包括技

术管理人员）的能力，且满足以下条件：

a）应具有病原分子生物学相关专业的教育经历；

b）应熟知生物安全操作知识和消毒要求，并具备实际操作技能；

c）有颜色视觉障碍的人员不能操作涉及到辨色的实验。

5.1.4人员培训和持续教育计划应包括动物检疫核酸标准物质的制备、贮存、运输、生物安全防护、

统计分析等内容。

5.2设备、服务和供应品的采购

5.2.1标准物质生产者应制定对标准物质质量有影响的设备、服务和供应品进行选择的政策和程序。

应根据程序的规定，选择保证其生产的标准物质的质量的设备、服务和供应品。

5.2.2标准物质生产者应保存其设备、服务和供应品的购买记录，包括所选用标准、验收确认书和所

有调试数据的记录。

5.2.3标准物质生产者应确保设备和耗材在经过检验、校准或质量验证符合标准样品生产的规格或要

求之后方可使用。

5.2.4动物检疫核酸标准物质生产者应确保每一区域应有专用的仪器设备，并贴有明确的标识，以避

免设备物品从其各自的区域内移出，造成不同的工作区域间的交叉污染。

5.2.5适用时，设备和供应品要定期进行期间核查以保证其性能持续符合要求。

5.2.6动物检疫核酸标准物质生产者应有专用的低温储存设备，标准物质生产材料不应与其他检测或

科研材料混放。

5.3设施和环境条件

5.3.1标准物质生产者应确保所有场所和设施的能源、照明、湿度、温度、压力和通风设备应有利于

材料处置、存储、制备、包装等。并应防止不相容的活动、振动、气溶胶、粉尘、微生物污染、磁场、

光和电磁场和/或电离辐射等其他环境因素的影响。

5.3.2动物检疫核酸标准物质生产者应有相应级别的生物安全实验室，应按照GB19489的规定使用与

生物安全等级相对应的生物危害标识。

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5.3.3动物检疫核酸标准物质生产者的实验室应设有分隔开的试剂配制与贮存区、核酸提取区、核酸

扩增区和扩增产物分析区，无菌区域和污染区域应张贴明显标识。应对进入和使用工作区域的人员进行

严格控制。不同的工作区域应使用有明显区别标志的工作服，人员离开工作区时不得将各区特定的工作

服带出。

6技术和生产要求

6.1生产策划

标准物质生产者在进行生产策划时应考虑材料的选择；材料的加工；测量程序的选择及确认；测量

设备的验证和校准；均匀性、稳定性检验方法选择和经过的接受准则；定值方式的设计；特性值的赋予；

不确定度的建立及评估；计量溯源性的建立；标准物质文件的发布；贮存设施和条件；标签、包装和运

输方案设计；生产后的稳定性监测等。

6.2标准物质候选物的选择

6.2.1标准物质候选物的数量、纯度及特性值应满足预期用途。标准物质候选物应具有足够的用量，

以满足批量生产的需求。其纯度应满足均匀性和稳定性的要求。其特性值应稳定且在可测量范围内，并

应经过适合性测试，如代表性、检测灵敏度、特异性等。

6.2.2标准物质候选物应由标准物质生产机构提供或从权威实验室获得，并具有稳定的获得途径。标

准物质候选物应具有可追溯的、详实的来源信息记录。应选用有效的方法验证其真实性，必要时可由多

家权威实验室进行联合验证。通过扩繁或继代培养的标准物质候选物，应重新验证其目标特性值。

6.2.3动物检疫标准物质生产者应按照GB19489的规定，根据动物检疫病原传播扩散的不同特点，对

标准物质候选物进行安全控制。核酸标准物质的生产应根据病原类型在相应生物安全级别的实验室内进

行，防止病原扩散传播，避免对操作人员和环境造成影响。

6.3标准物质的制备

6.3.1动物检疫核酸标准物质按照制备工艺流程和产物不同，可分为病原体灭活标准物质、病原体DNA

标准物质、病原体质粒DNA标准物质、病原体体外转录RNA标准物质、假病毒RNA标准物质等，具体制

备工艺流程见附录A。

6.3.2应根据标准物质的预期用途和病原微生物的特性，选择合理的原材料、制备方法和工艺流程。

6.3.3对目标特性值不易均匀的标准物质候选物，在制备过程中应采取必要的均匀措施。

6.3.4对目标特性值存在不稳定因素的标准物质候选物，在制备过程中应采取必要的稳定性措施。

6.3.5生产和存储动物检疫核酸标准物质的器具应确保不存在影响特性值的因子，如吸附性、渗透性、

水溶性等。

6.3.6动物检疫核酸标准物质的分装，应在特定条件下进行，避免生物、化学和物理方面的污染，同

一批次所有分装单元应在同一时间完成。

6.4溯源性分析

6.4.1核酸标准物质的特性值是序列，测定方法为序列测定，溯源标准为参考序列，证据文件为

GenBank标准序列，序列测定结果文件等。

6.4.2选取的病原体应溯源至具有代表性的参考菌、毒株。

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6.4.3核酸标准物质经过PCR扩增和电泳检测后，电泳条带明亮清晰、条带单一无杂带、片段长度与

预期一致。PCR产物应经过至少3家机构测序及BLAST分析，同源性应达到特定病原的要求。

6.5均匀性检验

6.5.1基本要求

6.5.1.1凡成批制备并分装成最小包装单元的动物检疫核酸标准物质，都应进行均匀性检验。均匀性

检验应采用相应病原的国家标准或行业标准推荐的核酸检测方法进行，通常采用PCR、实时荧光PCR或

数字PCR等方法。

6.5.1.2所有样品应以随机次序在重复性条件下进行测试，即在同一实验室中由相同的人员使用相同

的测试方法和仪器在较短时间内测试。

6.5.1.3定性（不具备数值）核酸标准物质的均匀性通过特异性条带大小以及标准曲线的斜率和截距

进行判定。

6.5.1.4定量（具备数值）核酸标准物质可采用统计学方法来判定均匀性检验结果，统计学方法可按

照GB/T15000.3的规定选择。

6.5.2取样方式、取样数目和最小取样量

6.5.2.1按照GB/T15000.3的规定从分装成最小包装单元的样品中抽样。取样应考虑引起特性值的差

异原因，从特性值可能出现差异的部位抽取，抽取的单元分布应有足够的代表性。当引起特性值的差异

原因未知或认为不存在差异时，可先将样品顺序编码，采用随机数表决定抽取样品的号码。

6.5.2.2当总体单元数少于等于200时，抽取单元数不少于11个；当总体单元数多于200但少于等于

500时，抽取单元数不少于15个；当总体单元数大于500但少于等于1000时，抽取单元数不少于25

个；当总体单元数大于1000时，抽取单元数不少于30个。对于均匀性好的样品，当总体单元数少于等

于500时，抽取单元数不少于10个；当总体单元数大于500时，抽取单元数不少于15个。

6.5.2.3最小取样量多少是由用来检验均匀性所采用的方法决定的，一旦最小取样量确定，该标准物

质定值和使用时都应保证用量不少于该最小取样量。

6.5.3结果判定

6.5.3.1定性（不具备数值）标准物质以扩增的特异性条带大小的一致性，以及标准曲线的斜率和截

距的一致性进行判定。

——若扩增的特异性条带大小一致且标准曲线的斜率和截距一致，则样品均匀；

——若扩增的特异性条带大小、标准曲线的斜率和截距任何一项不一致，则样品不均匀。

6.5.3.2定量（具备数值）标准物质采用适用的统计方法进行分析，得到统计值并与统计值分布表上

的临界值进行比较。

——若统计值小于临界值，表示无显著性差异，则样品均匀；

——若统计值大于临界值，表示有显著性差异，则样品不均匀。

6.6稳定性检验

6.6.1基本要求

6.6.1.1动物检疫核酸标准物质在规定的保存或使用条件下，应定期进行特性值的稳定性检验。稳定

性检验应在均匀性检验证明样品均匀性后进行。稳定性检验所用人员、仪器、测试方法和实验室都应与

均匀性检验相同。

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6.6.1.2标准物质有效期应不少于1年。保存期间需要对动物检疫核酸标准物质的稳定性条件进行连

续监测。在预期有效期间应有多个时间间隔的稳定性检验数据，同时记录稳定性检验期间的环境条件。

6.6.2温度和时间间隔

6.6.2.1运输稳定性测定温度为4℃、25℃，测定时间点为0周、1周、2周、4周等。

6.6.2.2长期稳定性测定温度为-20℃和-80℃，测定时间点为0月、1月、2月、3月、6月、9月、

12月、18月、24月等。

6.6.3样品的抽取

稳定性检验所用样品应从最小包装单元的样品中随机抽取。当标准物质有多个待定特性值时，应选

择那些易变的和有代表性的特性值进行稳定性检验。

6.6.4结果评价

分装成最小包装后的样品按时间顺序进行测量，可依据GB/T15000.3的规定选择适用的统计方法

进行稳定性检验结果评价。如测量结果在随机不确定度范围内波动，则该特性值在试验的时间间隔内是

稳定的。

6.7定值

6.7.1基本要求

6.7.1.1经过均匀性、稳定性检验合格并具有一定数量的标准物质方可进行定值。

6.7.1.2动物检疫核酸标准物质应采用多个机构合作定值的方式对标准物质的特性值进行确定。参与

合作定值的机构应具有技术权威性，并具有必备的环境和设施条件及所需的技术能力和经验。定值过程

所用量具和仪器，应在检定/校准合格的有效期内。

6.7.2定值方法

6.7.2.1可采用一种或多种准确可靠的方法对标准物质的特性值进行测量。当采用同一种定值测量方

法时，独立定值实验室数一般不少于8个；当采用多种定值测量方法时，独立定值实验室数一般不少于

6个。

6.7.2.2定性标准物质特性值为特定核酸序列。核酸标准物质经过PCR扩增和电泳检测后，电泳条带

明亮清晰、条带单一无杂带、片段长度与预期一致。PCR产物应经过至少3家机构测序及BLAST分析，

同源性应达到特定病原的要求。参与合作定值的所有结果应保持定性水平上的一致。

6.7.2.3定量标准物质特性值为特定核酸含量。不同机构的合作定值结果应选取适宜的统计学方法进

行检验。可进行格拉布斯（Grubbs）检验法或夏皮罗-威尔克（Shapiro-Wilk）检验法等进行正态分布

检验，在从正态分布或近似正态分布的情况下，再将每个机构的测定数值的平均值视为单次测量值，构

成一组新的测量数据，进行格拉布斯（Grubbs）检验法检验，剔除离群值后将该组数据的平均值作为认

定值。对非正态分布的数据以中间值定值。

6.8总不确定度的评估

6.8.1总不确定度的评定方法应按照GB/T27420中的有关技术及文书要求进行。

6.8.2认定值的总不确定量来源包括通过测量数据的标准偏差、测量次数及所要求的置性水平按统计

方法计算得出；通过对测量影响参数和影响函数的分析、估计得出；样品不均匀和样品在有效期内的变

动性所引起的不确定度等。

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7标准物质的文件和标签

7.1标准物质生产者应为有证标准物质发布提供标准物质证书，并为其他标准物质发布提供产品说明

书。

7.2标准物质证书和产品说明书应至少包括文件标题；标准物质的唯一性标识；标准物质的名称；标

准物质生产者的名称和联系信息；预期用途；最小取样量；有效期；储存信息；充分确保标准物质完整

性的处置与使用说明。标准物质证书还应包括有证标准物质的一般描述；特性值和相关不确定度；由程

序定义的被测量的测量程序；标准值的计量溯源性；标准物质生产者批准人的姓名和职务。

7.3标准物质标签应牢固地粘贴在标准物质独立包装单元的产品容器上，并应在标准物质的有效期内，

在规定的储存和处置条件下保持清晰和完整。标签应标明标准物质、生产者、批次及其他必要的信息，

使得标准物质能够被唯一识别和引用。当标准物质包装单元的实际尺寸限制了标签上的信息量时，这些

信息应包含在标准物质文件中，包装单元上应给出标准物质的唯一标识符。

8标准物质的包装与运输

8.1标准物质的包装应具有良好的密封性。根据动物检疫核酸标准物质的不同病原特性选择合适的包

装容器，例如，可采用避光、抽真空、防潮或惰性气体包装，以确保包装不对标准物质的特性值产生不

良影响。

8.2动物检疫核酸标准物质应保证低温运输，同时对于玻璃容器应有能够提供缓冲的外包装，并写有

“易碎品”字样。

9标准物质的储存

9.1标准物质生产者应确保标准物质有专门的储存场所或冰箱，并与化学试剂和其他用途材料隔离。

9.2密封后的动物检疫核酸标准物质应置于-20℃或-80℃储存，储存条件应与稳定性检验条件一致。

9.3应对储存标准物质的环境进行监控（如温湿度），保证储存环境条件的符合性及持续性。

10标准物质的管理

10.1动物检疫核酸标准物质制备完成后应对其实施合理有效地管理。

10.2应对在储存期内的动物检疫核酸标准物质进行检查，应对标准物质在整个储存期间的状况进行定

期评估。当发生动物检疫核酸标准物质过期、变质、包装破裂、标签破损等情况时，应及时将其从存放

处撤除，并用合适的方式处理，以免误用。

10.3标准物质生产者应建立标准物质外部评价程序，以确保所生产标准物质的质量。评价至少包括证

书规范评价和其特性值评价。证书规范性评价应按照GB/T15000.4、GB/T15000.7和我国标准物质管

理办法进行。特性值的评价应包括测量值、稳定性及均匀性。以上评价独立测量数目应不少于6个。

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附录A

（资料性）

A.1病原体灭活标准物质的制备

A.1.1工艺流程（见图A.1）

图A.1病原体灭活标准物质制备工艺流程图

A.1.2病原体的选择、鉴定和增殖

根据本文件6.2条所规定的原则选取病原体，采用标准方法进行分离、纯化、培养、生化鉴定和特

异性基因片段的PCR或实时荧光PCR检测，结果符合预期的病原体使用相应的标准方法进行增殖。

A.1.3样品的制备及灭活

选取适当的接种比例，将病原体接种到培养基（细菌）或细胞培养液（病毒）中，在标准方法规定

的条件下培养并收集纯化增值后的病原体。根据病原体特性选取适宜的物理或化学方法进行灭活，灭活

后离心取上清，并采用适当的方法对灭活效果进行评价。

A.1.4初步定值、分装和保存

提取灭活病原体DNA或RNA，并使用已知拷贝数的外标品，通过实时定量外标法经线性回归分析，获

得灭活病原体DNA或RNA的拷贝数。根据定值结果，用核酸保存液将灭活病原体离心取上清的产物稀释至

8

10Copies/µL，充分混匀后分装入冻存管中，加贴唯一性标识后，置-80℃保存。

A.2病原体DNA标准物质的制备

A.2.1工艺流程（见图A.2）

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图A.2病原体DNA标准物质制备工艺流程图

A.2.2病原体的选择、鉴定和增殖

同A.1.2。

A.2.3病原体DNA的提取和纯化

病原体DNA选用标准方法进行，DNA提取物溶解在pH8.0的TE缓冲液中，并在-20℃下保存备用。用

于制备病原体DNA标准物质的DNA相对分子质量应尽可能大，因此核酸提取过程中操作尽可能温和，提取

过程尽量在低温下进行。另外，制备的病原体DNA必须是高纯度的，没有蛋白质和RNA污染，各种离子浓

度也应符合要求，提取过程中使用的玻璃器皿、试剂、离心管等一次性用品都应经过严格灭菌消毒。

A.2.4核酸纯度的检测

采用分光光度计法测试DNA在260nm和280nm下的吸光度，以OD260/OD280的比值来判断提取的DNA纯

度。如果OD260/OD280在1.7～2.0之间，表明所提取的DNA较纯；当OD260/OD280<1.7时，说明所提取的DNA有

蛋白质污染；OD260/OD280>2.0时，说明提取的DNA有RNA污染。在提取的DNA不纯时，应重新提取。

A.2.5初步定值、分装和保存

使用已知拷贝数的外标品，通过实时定量外标法经线性回归分析，获得灭活病原体DNA的拷贝数。

8

根据定值结果，用核酸保存液将灭活病原体离心取上清的产物稀释至10Copies/µL，充分混匀后分装入

冻存管中，加贴唯一性标识后，置-80℃保存。

A.3病原体质粒DNA标准物质的制备

A.3.1工艺流程（见图A.3）

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图A.3病原体质粒DNA标准物质制备工艺流程图

A.3.2病原体的选择、鉴定和增殖

同A.1.2。

A.3.3质粒的构建

将病原体灭活后，进行基因扩增。应选择具有检测或分型意义的基因片段，选择的基因片段应足够

长，应涵盖一般检测方法和试剂的检测范围。获得的扩增产物进行纯化后连接到载体上，然后转化大肠

杆菌感受态细胞。PCR验证挑选阳性克隆，对插入片段进行测序确认，确保序列无突变，与已知序列完

全一致。

A.3.4质粒DNA纯度检测及初步定值

将测序正确的阳性克隆菌落大量培养，采用标准方法提取质粒DNA，采用紫外分光光度计法测试DNA

在260nm和280nm下的吸光度，以OD260/OD280的比值来判断提取的质粒DNA纯度。如果OD260/OD280在1.8～2.0

之间，表明所提取的DNA较纯；当OD260/OD280<1.8时，说明所提取的DNA有蛋白质污染；OD260/OD280>2.0时，

说明提取的DNA有RNA污染。若提取的DNA不纯，应重新提取。

质粒DNA浓度按照公式（A.1）计算，并根据质粒DNA分子量，按照公式（A.2）换算为Copies/µL。

DNA浓度（µg/mL）=OD260nm×50µg/mL×稀释倍数（A.1）

-114

DNA浓度（Copies/µL）=OD260nm×50×M.W.×6.02×10×稀释倍数（A.2）

A.3.5稀释、分装和保存

8

根据初步定值结果，用核酸保存液将制备好的质粒DNA稀释至10Copies/µL，充分混匀后分装入冻存

管中，加贴唯一性标识后，置-80℃保存。

15

XX/TXXXXX—XXXX

A.4病原体体外转录RNA标准物质的制备

A.4.1工艺流程（见图A.4）

图A.4病原体RNA标准物质制备工艺流程图

A.4.2病原体的选择、鉴定和增殖

同A.1.2。

A.4.3质粒的构建

同A.3.3。

A.4.4病原体RNA的体外转录

将纯化后的质粒用适当的限制性内切酶进行酶切。T7（或SP6）启动子与插入片段以及插入片段中

间不应有此限制性内切酶作用的酶切位点，而且酶切后的末端不形成5’悬挂。获得的线性化片段进行体

外转录，对获得的体外转录产物进行纯化。使用脱氧核糖核酸酶DNase除去其中的DNA模板，使用TRIZOL

再次抽提RNA，即得到体外转录病毒RNA母液。

A.4.5体外转录RNA纯度检测及初步定值

采用紫外分光光度计法测试RNA在260nm和280nm下的吸光度，以OD260/OD280的比值来判断体外转录

RNA纯度。要求OD260/OD280在1.9～2.1之间。RNA浓度按照公式（A.3）计算，并根据RNA分子量，按照

公式（A.4）换算为Copies/µL。

RNA浓度（µg/mL）=OD260nm×40µg/mL×稀释倍数（A.3）

RNA浓度（Copies/µL）=OD260nm×40×M.W.-1×6.02×1014×稀释倍数（A.4）