植物工厂化育苗教学课件 7继代培养

继代培养——植物工厂化育苗

继代培养（一）继代培养继代培养是继初代培养之后的连续数代的扩繁培养过程。目的：繁殖出相当数量的无根苗，最后能达到边繁边生根的目的。继代培养的后代是按几何级数增加的过程。

继代培养中扩繁的方法：①切割茎段：常用于有伸长的茎梢、茎节较明显的培养物。这种方法简便易行，能保持母种特性。②分离芽丛：适于由愈伤组织生出的芽丛。③分离胚状体：胚状体是愈伤组织在一定的培养条件下诱导形成的，类似胚的结构，具有胚芽和胚根，在合适的条件下可发育成为新的植株。④分离原球茎。

继代培养增殖方式1、定芽（包括顶芽，腋芽）发生型：

选取具有顶芽和腋芽的短枝无菌培养，诱导芽萌发成苗或增殖产生许多不定芽发育成苗，将新萌生的枝条再转接继代，重复芽到苗的增殖过程，最后使其生根形成植株的方式。将茎尖或者带有腋芽侧芽的茎段在培养基中进行诱导，使定芽，腋芽不断萌发，生长再生芽，再生成茎段最后形成丛生芽丛生茎段然后将丛生芽再进行分割，继续接种在继代培养基中，以此形式达到增殖效果。2、不定芽发生型：

除了叶腋和顶芽以外，从植物体上任何部位或组织产生的芽都称之为不定芽。植物许多器官都可以作为诱导不定芽产生的外植体，比如茎段，叶，叶柄花瓣等。繁殖方式与定芽发生型一样不断萌发生长，最后形成丛生无根植株，继续分割继代培养增殖，或者生根繁殖。与定芽发生型的区别就是新的幼苗植株产生的位置不同，上面产生在顶芽侧芽，这个产生的位置在其他部位。3、通过愈伤组织发生：

诱导器官外植体产生愈伤组织，经分化培养形成芽、根再生成植株的方式。

离体组培过程中植物材料通过激素诱导，已分化的组织经过脱分化,产生无序的分生状态的组织细胞团(愈伤组织)再经过培养再分化形成不同器官最后形成完整植株。

胚状体发生型：

指植物器官、组织和细胞外植体经培养脱分化形成胚状体再成苗的方式。

胚状体是组培苗的体细胞经过激素诱导脱分化形成的，胚状体与种子胚发育过程相似，通过球形、心形，子叶形的胚胎发育期，最后形成完整的小植株。胚状体可以从愈伤组织表面形成或者悬浮培养的细胞上得到。胚状体发育出的再生小植株与其他增殖方式发育出的小植株有两个显著不同的差异，一个是定芽，不定芽苗发育要先经过器官发生，在芽处发生单极性的枝条或无根苗，然后经过一个或一个以上培养阶段进行生根形成完整植物。

胚状体发育型特点：有明显的根端及茎段，具两极分化。而定芽不定芽是单极性的只是向上长枝条无根苗发育成的小植株。与周围愈伤组织或母体组织没有结构上的联系，小植株是独立形成的。易于与其它部分分离，不需要诱导生根阶段。定芽不定芽发育型由分生细胞团形成单极性生长点，发育成芽，随后转移到诱导生根培养基中进行生根培养成为完整植株。原球茎途径：即外植体经培养产生原球茎，再直接长成植株。

原球茎是兰花种子发芽过程中的一种形态学结构，种子萌发初期不像其他植物出现胚根，只是胚逐渐膨大，以后种皮一断破裂，胀大的胚成圆锥形称为原球茎。他是兰科植物特有的一种再生方式。

兰花组培中，常从茎尖或侧芽培养中产生原球茎，他本身增殖，一个芽周围能产生几个很多个原球茎，培养一段时间后，原球茎转绿，这时可长出毛状假根，可转移培养生根，形成完整植株。

如果是扩大繁殖，应该在转绿之前将其切割成小块或给予针刺等损伤，转移到新鲜增殖培养基上，可以增殖很多原球茎可以想增殖多少就繁殖多少。兰花最初每个茎尖或侧芽大约2个月左右产生3-5个原球茎，然后每个再切成4-6块，每一块在1个月内可产生3-5个原球茎。

培养基与培养条件选择

1、选择培养基或条件时首先查找文献，参考近缘品种的培养基配方成分及培养条件的要求。

2、在此基础上可用单因子试验或多因子试验。比如ms﹢NAA0.1-0.2﹢BA1-3

第一组：1-1ms﹢NAA0.1-0.2﹢BA11-2ms﹢NAA0.1-0.2﹢BA21-3ms﹢NAA0.1-0.2﹢BA3第二组2-1ms﹢BA1﹢NAA0.052-2ms﹢BA1﹢NAA0.1

6-BAmg/L）00.52.5510NAA012345(mg/L)0.56789102.5111213141551617181920102122232425

对培养基中两个或两个以上因素进行研究的试验称为多因子实验，各个因子的每个水平都相互搭配，构成了所有可能的处理组合，如研究NAA和6—BA的最佳浓度组合，每个因子各设5个浓度水平(0，0.5，2.5，5，10mg／L)，这两种因子各种浓度的所有组合，就构成了一个具有25项处理的试验。二、多因子试验2种激素5种浓度的实验组合在快速繁殖中初代培养只是一个必经的过程，继代培养达到相当的数量之后，则应考虑使其中一部分转入生根阶段。继代增殖只是贮备母株，而生根是增殖材料的分流，生产出成品。1、驯化，在植物组织培养的研究中，发现一些植物的组织经长期继代培养，发生一些变化，在开始的继代培养中需要生长调节物质的植物材料，其后加入少量或不加入生长调节物质就可以生长，此现象就叫作“驯化”。芽又细又弱

2、不同的植物其保持再生能力的时间是不同的，而且差异很大，在以腋芽或不定芽增殖继代的植物中，在培养许多代之后仍然保持着旺盛的增殖能力，有的则出现再生能力丧失问题。注意;一般能达到每月继代增殖3倍—10倍，即可用于大量繁殖，盲目追求过高增殖倍数，一是所产生的苗小而弱，给生根、移栽带来很大困难；二是可能会引起遗传性不稳定，造成灾难性后果。试管苗继代培养几种现象影响继代培养的一些因素（1）植物材料的影响（2）培养基及培养件（3）继代培养时间长短（4）季节的影响（1）植物材料的影响

不同种类植物，同种植物不同品种，同一植物不同器官和不同部位继代繁殖能力也不相同。一草本＞木本；被子植物＞裸子植物；年幼材料＞老年材料；刚分离组织＞已继代的组织；胚＞营养体组织；芽＞胚状体＞愈伤组织。（2）培养基及培养条件培养基及培养条件适当与否，对能否继代培养影响颇大。如：在水仙鳞片基部再生子球的继代培养中，加活性炭的培养基中再生子球比不加活性炭的要高出一至几倍。（3）继代培养时间长短

长期继代可保持原来的再生能力和增殖率，如：葡萄、月季和倒挂金钟等。有的经过一定时间继代培养后才有分化再生能力。如：潘景丽等进行沙枣愈伤组织继代培养6次后，才分化苗，保持二年，仍具有分化能力。有的随继代时间加长而分化再生繁殖能力降低，

如：杜鹃茎尖外植体，通过连续继代培养，产生小枝数量开始增加，但在第四或第五代则下降，虽可用光照处理或在培养基中提高生长素浓度，以减慢下降，但无法阻止，因此必须进行材料的更换。（4）季节的影响

有些植物材料能否继代与季节有关。

如：水仙取6、7月份的鳞茎，因夏季休眠，生长变慢，8月休眠后，生长速度又加快。百合鳞片分化能力的高低表现为春季＞秋季＞夏季＞冬季。球根类植物组织培养繁殖和胚培养时，就要注意继代培养不能增殖，是因其进入休眠，可通过加入激素和低温处理来克服。唐菖蒲在MS培养基上得到的球茎，移植于MS培养基中，无机盐和糖浓度减半，并增加萘乙酸用量，可以防止继代中的休眠。继代培养步骤（1）超净工作台灭菌：接通电源，打开紫外灯，同时打开风机，灭菌20min；（2）人员准备：洗净双手，穿上实验服进入接种室。在超净台内用酒精棉球（或新洁尔灭稀释液）擦拭双手，台面及接种工具、种苗瓶表面。（3）种苗瓶准备：要选择生长势好，苗高在3cm以上种苗瓶，每人取10瓶的装有继代培养基的培养瓶放入超净台内；（4）转接前准备：将酒精灯放在距超净台边缘30cm，正对身体正前方处。将种苗瓶放在灯前偏左处，继代培养瓶放在灯前处，消毒瓶放在灯右处，以利方便操作；

（5）转接：打开原种瓶，将瓶口过火一次，置于一定位置。剪刀和镊子灼烧灭菌后，左手水平持种苗瓶，右手持镊子，使种苗瓶瓶口与右手所持的镊子在同一水平线上，将芽丛从瓶中取出，放在无菌滤纸上，用手术刀和镊子配合对芽丛进行分割，并把每个小枝条切割成1-1.5cm的茎段，每个茎段上至少应带有一个腋芽。打开盛有继代培养基的培养瓶，瓶口过火一次，用过火、冷却的镊子夹住分割的茎段并迅速转接在瓶中，每瓶转接5～6个茎段，接完后瓶口过火封口。以后重复上述动作，每人接10瓶。（6）每接5瓶后，再用酒精棉球擦拭双手一次，以防交叉感染；（7）每接完10瓶后，写明接种日期、品种编号、培养基编号和姓名等，移出超净台，置于台顶，再接下一批；（8）转接结束