酶的海藻酸钠法包埋固定化

生物与化工学院教案 生物与化工学院教案课程名称海洋生物技术(实训)教学内容（项目)酶的海藻酸钠法包埋固定化授课进度实训教学日期及课节共（4）学时教学地点实训室教学目标1.能按规程进行生产操作；2.会做清场清洁工作；3.会填原始记录；4.会对生产中出现的问题进行正确判断和分析；5.掌握果胶酶的海藻酸钠包埋固定化方法6.掌握果胶酶的活力测定原理与方法教学重点1、掌握果胶酶的活力测定原理与方法2、掌握果胶酶的海藻酸钠包埋固定化方法。教学难点1、掌握果胶酶的活力测定原理与方法2、掌握果胶酶的海藻酸钠包埋固定化方法。教学设计教学环节时长（分钟）教学过程及内容设计教学方法讲解20分钟一.实验原理固定化细胞或酶即利用物理或化学方法将细胞或酶固定在一定空间的技术。果胶酶的固定化由于酶具有高效催化作用，果胶酶被广泛应用于食品加工和酿酒等工业中。目前，果胶酶已成为世界四大酶制剂之一。尽管如此，不少与应用有关的问题仍有待解决。如酶的稳定性差，在温度、pH值和无机离子等因素的影响下容易失去活性；酶在水中与底物进行反应，反应后的酶即使还有活性也难于分离和再利用，因而生产成本高；同时，酶很难从反应体系当中分离出来用于连续的工业化生产；酶反应的产物与底物同时存在于同一反应体系中，反应后，酶的存在使得产物的分离纯化难度加大，杂质含量高。由于这些不足之处，使酶的应用范围受到一定的限制，使果胶酶的潜力未能充分发挥出来，固定化酶提供了解决问题的方法。在果胶酶的固定化中，对各种固定化方法都作了一些尝试，北京师范大学张来群用尼龙网作载体，经3一二甲氨基丙胺活化，用戊二醛将果胶酶固定化；福建省亚热带植物研究所刘新民用海藻酸钠、二醋酸纤维和明胶分别作为载体，对果胶酶进行了固定化；吉林大学的张应玖用重氮化的对一氨基苯磺酰乙基纤维素为载体，制备固定化果胶酶；靳晓红用离子交换树脂对果胶酶进行固定化；浙江大学朱祥瑞等人把家蚕丝素分别与果胶酶通过吸附以及与戊

二醛交联结合，制备了不同形状固定化酶；陈峰等人比较了不同载体通过吸附和包埋法对米曲霉C491果胶酶进行固定化；李秀锦等人以壳聚糖为载体，以戊二醛为交联剂，研究了果胶酶的固定化；王宏等人利用海藻酸钠为载体固定化果胶酶。果胶酶的固定化将有助于提高酶的利用率，同时还可减少外源物质对果制品的污染。然而固定化酶的性能除取决于固定化方法外，还取决于在固定化中所使用的载体。酶固定化对载体材料具有很高的要求，如要有良好的机械强度、良好的热稳定性和化学稳定性、良好的抗微生物特性及酶的结合能力等。讨论法分工、试剂配制等20分钟二.实验器材果胶酶，无水CaCl2，海藻酸钠，玻璃棒，200mL烧杯，榨汁机，水浴锅，水果，容量瓶100毫升，试管，试管架，离心机，离心管，电子天平，胶头滴管，移液管，吸耳球，一次性注射器讲授法,演示法教学环节时长（分钟）教学过程及内容设计教学方法教师演示与学生实操120分钟三．实验步骤1．配制2%果胶酶溶液2．配制浓度为0.05mol/L的CaCl2溶液：称取无水CaCl20.83g，放入200mL的烧杯中，加入150mL的蒸馏水，使其充分溶解，待用。3．配制海藻酸钠溶液：称取0.7g海藻酸钠，放入50mL小烧杯中.加人10mL水，用酒精灯加热，边加热边搅拌，将海藻酸钠调成糊状，直至完全溶化，用蒸馏水定容至10mL。注意，加热时要用小火，或者间断加热，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止。海藻酸钠的浓度涉及到固定化酶的质量。如果海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酶少，影响实验效果。4．海藻酸钠溶液与果胶酶混合：将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入果胶酶溶液，进行充分搅拌，使其混合均匀，再转移至注射器中。5．固定化酶：以恒定的速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到配制好的CaCl2溶液中，观察液滴在CaCl2溶液中形成凝胶珠的情形。将这些凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡30min左右。刚形成的凝胶珠应在CaCl2溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。检验凝胶珠的质量是否合格，可以使用下列方法：一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。观察凝胶珠的颜色和形状:如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败，需要再作尝试。6．固定化酶活测定：参照实训三果胶酶对果汁的澄清效果检验Ⅰ：取五支18*180试管，其中一支标为空白管，4支标为试验管，分别向五支试管中加入稀释10倍的果汁10ml。Ⅱ：五支试管于45℃水浴锅中保温10min。Ⅲ：向4支试管中分别加入果胶酶液1ml，固定化果胶酶1毫升，空白管不加。Ⅳ：五支试管于45℃水浴锅中精确保温10min。Ⅴ：反应完后，迅速取出，将反应液倒入离心管中离心（4000r/min）5min。Ⅵ：以蒸馏水为参照比，在660nm测透光率。T透光率=︳T样品-T空白︱四、结果分析1．固定化果胶酶酶活比较（Excel做柱形图）2.酶活力回收率的测定：酶活力回收率=固定化酶的酶活÷酶液初始总酶活×100％思考：固定化酶的优点多媒体教学；讲授法；讨论法思维碰撞20分钟讨论-思维碰撞（作业）1实训结果展示交流与讨论.2在分组实训中，若失败，利用课后讨论及利用课余时间实训。3课后做出详细结果分析并写出书面总结报告。讨论法教学意见及建议：《海洋生物技术》是一门理实一体化的跨专业选修课程，采用基于数字化教学平台的翻转课堂教学模式，有QQ群师生交流平台，多师同堂。课堂采用多媒体教学、讲授法、研讨法、直观教学。采用工作任务驱动，项目导向的案例教学法