洋葱内表皮细胞骨架的观察

洋葱内表皮细胞骨架的观察

洋葱内表皮细胞骨架的观察一、实验目的

1、掌握植物细胞骨架显示的原理及染色方法.2、观察光学显微镜下细胞骨架的网状结构二、实验原理

细胞骨架（cytoskeleton）是指真核细胞中的纤维蛋白所组成的网络结构。①、细胞骨架的概念红：微丝绿：微管微管主要成分微管蛋白微管主要分布在核周围，呈放射状向四周扩散电镜下的微管1.微管蛋白（一）微管的化学组成微管蛋白

微管蛋白

微管蛋白异二聚体2个鸟嘌呤核苷酸（GTP)结合位点。可与秋水仙素、长春花碱结合。

微管蛋白

微管蛋白异二聚体聚合首位相连原纤维微管（13）微丝的形态与组分形态：是一类由蛋白纤维组成的实心纤维细丝。直径5-7nm，长短不一。在细胞中，微丝可成束、成网或纤维状分散分布，主要分布与细胞质膜的内侧。在具有运动功能的细胞中比较发达。

微丝化学成分肌动蛋白肌动蛋白结合蛋白

中间丝

直径介与微管与微丝之间，故得名中间丝（中间纤维IF）

8——10nm。中间纤维则分布在整个细胞中。

IF结构稳定：既不受秋水仙素也不受细胞松弛B素影响，并且也没有极性。二、实验原理细胞骨架细胞生长、运动维持细胞形态分裂、分化基因表达能量转换信息传递物质运输②细胞骨架的功能微管微丝中间丝

二、实验原理

③细胞骨架组成及分类

根据组成成分及形态结构细胞质骨架细胞骨架细胞膜骨架细胞核骨架细胞外基质细胞质骨架广义狭义二、实验原理

④细胞骨架观察方法电镜组织化学间接免疫荧光酶标观察方法二、实验原理

⑤试剂选用原因1TritonX-100可溶解抽提细胞中的蛋白质和脂质，但不破坏细胞骨架系统，因此显得更清晰3M-缓冲液洗涤细胞，可以提高骨架稳定性2戊二醛固定能较好保存骨架成分、考马斯亮蓝R250染色，使骨架蛋白着色，胞质背景着色弱，有利于骨架显示

注意微丝微管和中间丝都是直径很小的结构，最大的单根微管才25nm左右，只能在电镜下观察。本实验用普通光镜是因为骨架纤维成束分布，染色后有夸大作用。由于细胞经抽提后剩下的主要是细胞骨架，使之显现更清晰。M缓冲液M缓冲液使细胞骨架中的微丝保持稳定。在M缓冲液中，其中咪唑是缓冲剂EGTA和EDTA螯合Ca离子，溶液并提供Mg离子，在低钙条件下，骨架纤维保持聚合状态并且较为舒张，便于观察。TritonX-100（聚乙二醇辛基苯基醚)是一种非离子型表面活性剂（或称去污剂）。分子量为646.86（C34H62O11）。它能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性。非离子型表面活性剂它在水溶液中不产生离子的一种表面活性剂。它在水中的溶解是由于它具有对水亲和力很强的官能团。表面活性剂表面活性剂分子结构具有两亲性：一端为亲水基团，另一端为疏水基团。溶解于水中以后，表面活性剂能降低水的表面张力，并提高有机化合物的可溶性。考马斯亮蓝G-250考马斯亮蓝有G-250和R-250两种。其中考马斯亮蓝G-250由于与蛋白质的结合反应十分迅速，常用来作为蛋白质含量的测定。3%-戊二醛作为一种有机交联剂戊二醛在一定条件下能将单体、线型高分子或预聚物转变成三维网状结构的物质。戊二醛在1%浓度时，交联度已达到很高的程度，在此浓度以下，随浓度下降，交联度下降，溶胀度和降解率增加。浓度超过1%时，各指标无明显变化。交联剂是一种能在线型分子间起架桥作用，从而使多个线型分子相互键合交联成网状结构的物质。促进或调节聚合物分子链间共价键或离子键形成的物质。三、实验用品1、材料2、器材3、试剂洋葱鳞茎显微镜、小烧杯、滴管、载玻片、盖玻片、镊子⑴M-缓冲液⑵6mmol/L磷酸缓冲液⑶1%TritonX-100⑷0.2%考马斯亮蓝R250⑸3%戊二醛②3.0%戊二醛：用0.2mol/L磷酸盐缓冲液配制

③0.2％考马斯亮蓝R250：甲醇46.5ml，冰乙酸7ml，蒸馏水46.5ml三、实验用品

4、试剂配制①1%TritonX-100：一般配成30%储备液，通常TritonX-100与M-缓冲液以所需比例混合置于30-40℃水浴2-3小时，以便液体充分混匀。使用时将30%储备液临时稀释成1%。

③M-缓冲液四、实验方法1、撕取2、抽提3、冲洗4、固定吸去缓冲液，用1%TritonX-100处理洋葱表皮25min。3％戊二醛固定30min撕取洋葱鳞茎内表皮细胞约1cm2大小若干片，置于磷酸缓冲液的培养皿中，使其下沉，（1~2min)吸去TritonX—l00，用M一缓冲液洗3次，每次5分钟四、实验方法5、冲洗6、染色7、制片8、观察PH6.8磷酸