1.2发酵工程的无菌技术+第2课时+课件+高二下学期生物苏教版选择性必修3

第二节发酵工程的无菌技术第一章

发酵工程第2课时菌种是从事发酵工程实践及微生物学等学科研究的基本材料和重要资源。因此，菌种的传代和保存至关重要。菌种的传代和保存要考虑菌种的生理、生化特性，尽量让菌种在人工创造的条件下，降低细胞的代谢水平，使细胞基本处于休眠状态，即微生物的生长繁殖受到抑制但又不至于死亡。低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都有抑制微生物生长和代谢的作用。因此低温、干燥、真空是菌种保存的重要条件。厌氧微生物接触氧气会受到抑制、损伤甚至死亡，常采用穿刺接种的方法将其保护在培养基中。厌氧菌可在培养基深处的厌氧环境下生长。斜面接种是常用的菌种传代和低温下保存菌种的方法。情境导入边做边学：斜面接种和培养酵母菌培养酵母菌准备接种接种环灭菌试管口灭菌挑取少许菌体划线接种斜面接种和培养酵母菌的操作步骤及其目的或分析说明顺序接种操作步骤目的或分析说明①将接种环的环端和接种时可能进入试管的部分放在酒精灯火焰上，来回灼烧多次将接种环灭菌，避免污染菌种②迅速将试管口通过火焰2～3次灼烧灭菌，防止试管口上的微生物污染培养基③将灭过菌的接种环伸入菌种管，先将环部接触培养基斜面顶端或其他无菌体的培养基部位使接种环冷却，避免杀死菌种边做边学：斜面接种和培养酵母菌斜面接种和培养酵母菌的操作步骤及其目的或分析说明顺序接种操作步骤目的或分析说明④抽出接种环时，带菌部位不要触及管壁或通过火焰防止菌种沾于管壁；防止菌种被杀死⑤在培养基斜面上由底部向上轻轻划“Z”型折线，但不要将培养基的表面划破初步接种。划破培养基不利于后续的继续划线，长出的菌落不标准⑥将试管口与试管塞分别通过火焰2～3次，迅速塞紧试管防止杂菌污染⑦将接种过菌种的试管，放在恒温箱(28℃)中培养24h培养酵母菌，观察接种和培养的结果边做边学：斜面接种和培养酵母菌边做边学：斜面接种和培养酵母菌讨论：1.培养24h后，能观察到的实验结果是什么？如何将酵母菌培养在平板培养基上？2.在上述接种和培养过程中，我们注意到了哪些灭菌操作注意事项？微生物的菌种保存一般需要先挑选典型菌落，再接种在斜面培养基上，按规定的温度和时间培养；待充分生长后，将培养好的装有新鲜菌种的试管用牛皮纸包扎好，置于4℃左右的冰箱中保藏，以减缓培养基的水分蒸发，延长保存时间。通常每隔2~3个月重新接种一次，再继续保存。微生物分离、纯化和培养的无菌技术平板划线法是指把含有多种微生物的杂菌样品，通过在特定的琼脂平板表面划线稀释，从而获得单个菌落的方法。连续划线法分区划线法通过平板划线法获得纯化的酵母菌菌落尝试通过平板划线法获得纯化的酵母菌菌落。实验目的实验原理马铃薯葡萄糖琼脂培养基能满足酵母菌生长、繁殖的营养需要，利用前面实验中配制的马铃薯葡萄糖琼脂培养基制作平板。平板划线法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法之一。在制作好的酵母菌培养基平板上，采用无菌操作技术及平板划线法能够获得纯化的酵母菌菌落。实验器材和试剂酵母菌样本（菌种），接种环，酒精灯，恒温培养箱，高压蒸汽灭菌锅，马铃薯葡萄糖琼脂培养基。通过平板划线法获得纯化的酵母菌菌落实验步骤1.培养基和培养皿灭菌通过平板划线法获得纯化的酵母菌菌落配制培养基：实验步骤1.培养基和培养皿灭菌通过平板划线法获得纯化的酵母菌菌落灭菌：通过平板划线法获得纯化的酵母菌菌落实验步骤2.倒平板注意待培养基冷却至50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。①温度：50℃左右②操作：在酒精灯火焰附近③冷凝后平板倒置防止瓶口微生物污染培养基防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染温度过高容易烫伤，低于50℃琼脂会凝固。避免杂菌污染。实验步骤3.划线和培养参照图1-2-16，在平板上划线，然后置于28℃恒温培养箱。通过平板划线法获得纯化的酵母菌菌落①灼烧接种环，直至接种环金属丝烧红⑥将皿盖打开一条缝隙，将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划3-5条平行线，盖上皿盖。⑤试管口通过火焰，并塞上棉塞②在火焰旁冷却接种环，拔出酵母菌培养液试管的棉塞③试管口通过火焰④在火焰附近用接种环蘸取一环菌液⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。1.接种环只蘸一次菌液，但要在培养基不同位置连续划线多次；2.划线首尾不能相接；3.每次划线前灼烧接种环进行灭菌；4.划线操作结束后，仍需灼烧接种环。接种环灭菌接种环灭菌第3区划线接种环灭菌接种环灭菌12345通过平板划线法获得纯化的酵母菌菌落完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右（培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的恒温培养箱中培养24~48h。在实验室中，切不可吃东西、喝水，离开实验室时一定要洗手，以防止被微生物感染。使用后的培养基在丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。警示对照：说明培养基是否被杂菌污染。通过平板划线法获得纯化的酵母菌菌落结果与分析培养24h后，若在划线的末端出现不连续的单个菌落，表明酵母菌已经被纯化。如果酵母菌纯化培养失败，其原因很多。例如，接种环在取菌体前曾在酒精灯火焰上灼烧灭菌，此时接种环的温度很高，若不冷却就直接在斜面上挑取菌体，菌体可能因为接触高温接种环而死亡。此外，若第一次划线前挑取的菌体过多，则也可能无法获得由一个酵母菌形成的单个菌落。通过平板划线法获得纯化的酵母菌菌落1mL1mL1mL1mL1mL1mL1×1021×1031×1041×1051×1061×1079mL无菌水1×10稀释涂布平板法分离和纯化微生物稀释涂布平板法也是常用的分离和纯化微生物的方法。还可用于微生物计数。1.梯度稀释菌液将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。移液枪待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30~37℃的恒温箱培养1~2天。2.涂布平板

稀释涂布平板法分离和纯化微生物稀释涂布平板操作后分离得到单菌落稀释涂布平板法分离和纯化微生物常用微生物分离方法比较比较平板划线法稀释涂布平板法工具接种环涂布器操作接种环在固体培养基表面连续划线系列梯度稀释操作和涂布平板操作特点方法简单，但不适宜计数单菌落更易分开，可以计数，但操作复杂，需涂布多个平板结果共同点都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可用于观察菌落特征稀释涂布平板法分离和纯化微生物有些微生物的分离和纯化还可采用混合平板法，即将稀释的少量菌悬液与50℃左右的培养基混合均匀后倒入无菌培养皿中，再将培养皿置于合适温度下培养，这样在培养基表面和内部均可长出单个菌落。有人说，采用稀释涂布平板法培养和计算得到的微生物的数量比稀释液中实际微生物的数量要少。你同意这样的观点吗？同意，稀释涂布计数是根据微生物在平板表面上所形成的单个菌落来计数的，一个菌落代表一个单细胞。实际计数时，往往会出现菌落聚合在一起的情况，因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，稀释涂布平板法统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。分离土壤中分解尿素的细菌并进行计数1.学会配制选择培养基，以分离出能分解尿素的细菌。2.学会采用稀释涂布平板法分离和培养分解尿素的细菌，并进行数。实验目的实验原理在自然环境中，多种微生物常常生活在一起，要对其中的某种微生物进行研究，就必须对其进行分离和纯化培养，以排除其他微生物的干扰。由于不同微生物对营养成分、氧、pH等的要求不同，通过提供要研究的微生物增殖生长的必需条件，或加入某些抑制剂抑制其他微生物的增殖生长，可分离和纯化所需的微生物。在实验室中利用选择培养基可以筛选和分离某种微生物，然后在高度稀释的条件下，于固体培养基上培养该微生物，形成单个菌落。单个菌落即为纯化培养物，通过对菌落数量的统计，可以计算出样品中的含菌数。分离土壤中分解尿素的细菌并进行计数实验器材和试剂1.土壤样品。2.灭菌处理过的移液管、试管、玻璃涂布器、锥形瓶、培养皿、烧杯，试管架、记号笔、天平、称量纸、洗耳球、酒精灯。3.配制以尿素为氮源的1000mL选择培养基的试剂，包括KH2PO41.4g、Na2HPO42.1g、MgSO4·7H2O0.2g、葡萄糖10.0g、尿素1.0g、琼脂15.0g、蒸馏水1000mL、无菌水适量以及调节pH的相关试剂。分离土壤中分解尿素的细菌并进行计数实验步骤1.选取土壤1×102.制备土壤悬液3.配制培养基及制作平板4.涂布分离土壤中分解尿素的细菌并进行计数实验步骤4.涂布：从浓度最低的土壤悬液（质量浓度为10-8g·L-1）开始，先用无菌移液管吸取0.1L加入到标记有10-8的培养皿中，再分别用无菌移液管从质量浓度为10-7g·mL-1、10-6g·mL-1的土壤悬液中各吸取0.1mL加入到标记有10-7、10-6的培养皿中，每个浓度设置3个重复，在平板上涂布均匀。分离土壤中分解尿素的细菌并进行计数分离土壤中分解尿素的细菌并进行计数实验步骤5.培养与观察：将已经标明培养基种类、培养日期以及样品稀释度的培养皿，倒置于37℃恒温箱中培养1~2d。每24h观察一次每个培养皿中的细菌菌落。6.计数菌落：取出已培养1~2d的平板，统计每个培养皿中的菌落数。计算时，选取菌落数为30~300的一组为样本进行统计。每克土壤样品的细菌数=某一稀释度几次重复培养后的菌落平均数×稀释倍数：涂布所用稀释液体积数。分离土壤中分解尿素的细菌并进行计数M：代表稀释倍数；C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)4号试管的结果表明每克土壤中的活菌数约为________个计算公式：每g样品中的菌落数＝(C÷V)×M1.1×108分离土壤中分解尿素的细菌并进行计数结果与分析菌落数目在30~300的一组平板上一般可以获得单个分解尿素的细菌菌落。通过统计菌落数，可获得每克土壤样品中分解尿素的细菌数。知识拓展——菌种鉴定分离土壤中分解尿素的细菌并进行计数实验中得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？不一定，还需要进一步的鉴定混合样品得到的菌落不一定就是分解尿素的细菌，如自生固氮菌或利用（分解尿素的）细菌的代谢物进行生长繁殖的微生物在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→酚红变红酚红培养基——鉴定分解尿素的细菌脲酶CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3知识拓展——菌种鉴定知识拓展——菌种鉴定鉴别培养基：在培养基中加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应。从而达到鉴定目标微生物的作用。伊红-亚甲蓝琼脂培养基鉴别大肠杆菌（若有，菌落呈深紫色，有金属光泽）刚果红培养基鉴别纤维素分解菌微生物的基本培养技术无菌技术煮沸消毒法纯培养培养基固体培养基接种分离的方法平板划线法稀释涂布平板法种类液体培养基营养成分水、碳源、氮源、无机盐消毒巴氏消毒法灭菌湿热灭菌干热灭菌灼烧灭菌化学消毒法紫外线消毒法根据物理性质概念课堂小结随堂训练1.下列有关用平板划线法接种的操作，错误的是A.将接种环放在火焰上灼烧B.用已冷却的接种环挑取菌体C.用取菌体和划线都要在火焰旁进行D.接种环划线要将最后一区的划线与第一区的划线相连√解析：划线时，不能将最后一区的划线与第一区的划线相连，D错误。2.下列有关微生物的分离与培养的叙述，错误的是A.获得纯净培养物的关键是防止杂菌污染B.倒置平板可防止培养皿盖上的冷凝水滴落造成污染C.倒平板时将培养皿的盖拿开，以便于将锥形瓶中的培养基倒入培养皿D.检验培养基是否被杂菌污染的最有效方法是将接种等体积无菌水的培

养基放在恒温箱中培养√解析：倒平板时用食指和拇指将培养皿打开一条稍大于锥形瓶瓶口的缝隙，使其恰好能让锥形瓶瓶口伸入，随后倒入培养