DB37T 3122-2018 槐花多糖提取工艺及其生物活性评价技术规程　

DB37DB37/T3122—2018槐花多糖提取工艺及其生物活性评价技术规程BiologicalActivityEvaluation山东省质量技术监督局发布IDB37/T3122—2018本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准由山东农业大学、山东省动物疫病预防与控制中心负责起草。本标准主要起草人：朱瑞良、魏凯、胡莉萍、孙振红、黄河、郝智慧、闫振贵、王慧军、裴宗飞。1DB37/T3122—2018槐花多糖提取工艺及其生物活性评价技术规程1范围本规程适用于槐花多糖用作动物用免疫佐剂和免疫增强剂的制备和检验。件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB14925实验动物环境及设施GB/T14926.54实验动物血凝抑制试验下列术语和定义适用于本文件。当中的主要抗体。在肠道黏膜免疫当中起到关键作用的是分泌型免疫球蛋白A(Secretory3.2血凝试验(hemagglutinationtest,HA)是指某些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝，也称直接血凝反应，利用这种特性设计的试验称血凝试验。血凝抑制试验(hemagglutinationinhibitiontest,HI)是指当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触，这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为血凝抑制，利用这种特性设计的试验称血凝抑制试验。3.32DB37/T3122—20184.1牛血清白蛋白(BSA),配制方法见附录A。5.16分光光度计(380nm～780nm)。3DB37/T3122—20186.1采集新鲜盛开的槐花，去梗后放入恒温干燥箱中于70℃烘干，用超微粉碎机粉碎成粉末状，过40目筛，装入密封袋，-20℃保存。6.2称取一定量的槐花粉与去离子水按体积1:25混合，用pH计调节pH至4.5,加入终浓度0.25%的纤维素酶，45℃水浴中浸提1h,提取4次，合并4次上清液，用旋转蒸发仪减压浓缩至1/5体积。6.3浓缩液用Sevag试剂(配制方法见附录A)除蛋白，重复两次，最后加入4倍体积的无水乙醇使多糖沉淀，对析出的多糖进行离心，冷冻干燥后即为槐花多糖。7.290%苯酚液的配制量取苯酚90mL,用去离子水定容至100mL,即得90%苯酚液，棕色瓶7.36%苯酚液的配制将90%苯酚液稀释至6%,即一体积储存液对应十四体积去离子水，临用现配。放置20min,取出后用凉水冷却10min,以0号作为空白调零，在最大吸收波长处(490nm)测定吸光归方程。管号01234567葡萄糖(mL)苯酚液(mL)浓硫酸(mL)将提取得到的待测多糖用去离子水溶解，定容至100mL,取溶解后的溶液，按标准曲线中的测定方法，以样液为参比液，测定溶液的吸光值，按回归方程计算待测溶液的多糖浓度，乘以稀释倍数则为多糖含量。4DB37/T3122—2018用苯酚-硫酸法测的多糖含量大于80%以上，视为提取的槐花多糖合格。将240只SPF雏鸡，随机分为4组，每组60只。I、Ⅱ、Ⅲ组为试验组，于9~12日龄，每天颈部皮下注射0.25mL槐花多糖溶液。其中I、Ⅱ、Ⅲ组槐花多糖含量分别为200mg/mL、100mg/mL、50mg/mL,IV组为对照组，注射生理盐水。12日龄时各组免疫鸡新城疫灭活苗，于免疫后3d、7d、14免疫7天后，各组随机取15只雏鸡，称量体重(称重前12h停饲停水),剖杀前采集血液(检测后续指标用),分别摘取胸腺、法氏囊、脾脏并称重，计算出胸腺指数[胸腺重(g)/活体重(kg)],法氏囊指数[法氏囊重(g)/活体重(kg)],脾脏指数[脾脏重(g)/活体重(kg)]。血凝(HA)与血凝抑制(HI)试验检测雏鸡血清抗体水平。血凝(HA)与血凝抑制(HI)试验依据GB/T14926.54。用一次性医用抗凝管采集各组雏鸡的抗凝血1mL,用全自动血细胞分析仪测定雏鸡血液内白细胞雏鸡剖杀后，取10cm长的十二指肠段，用3mL1%BSA-PBS反复冲洗3次后，8000rpm离心取上清，用商品化ELISA试剂盒检测上清中SIgA的含量。5DB37/T3122—2018AA(资料性附录)溶液的配制A.1.1牛血清白蛋白(BSA)的配制将100mg的牛血清白蛋白加入9.5mL水中(须将蛋白加入水中，而不是将水加入蛋白中),盖好盖后，轻轻摇动，直至牛血清白蛋白完全溶解为止。加水定容到10mL,然后分装成小份贮存于-20℃。A.2Sevag试剂的配制氯仿：正丁醇=5:1(V/V)混合。A.3磷酸盐缓冲溶液(PBS)的配制取ZLI-9061PBS溶于1000mL的蒸馏水中，混匀，测pH值应在7.2~7.4之间，若偏离此范围，请用A.41%鸡红细胞的配制A.4.1配制1%红细胞悬液时最好选择2～3只SPF鸡或未进行过任何免疫过的成年公鸡血液，采血时按十分之一采血量比例在一次性注射器中加入抗凝剂，如肝素或枸椽酸钠等。A.4.2采血完毕后最好分装至2mL容量的圆底离心管中，经2000r/min~3000r/min,5min~10m