DB37T 3105-2018 向日葵种子纯度蛋白电泳检测标准　

DB37DB37/T3105—2018向日葵种子纯度蛋白电泳检测标准山东省质量技术监督局发布IDB37/T3105—2018本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省农业厅提出。本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：山东农业大学、北京德农种业有限公司。本标准起草人：张春庆、赵洪春、郑建鹏、温大兴、李岩。本标准为首次发布。1DB37/T3105—2018本规程适用于向日葵品种及杂交种种子的纯度室内的快速鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB3543种子检验技术规程GB20464农作物种子标签通则3术语和定义3.1杂交种各种直接用于生产的杂交向日葵一代种子。3.2品种纯度品种在特征特性方面典型一致的程度，用本品种的种子数占供检本作物样品种子数的百分率表示。3.3标准样品能够充分代表种或品种特征特性的种子样品，或具备指定特征、特性样品。4原理4.1不同品种遗传组成不同，在种子形成时期合成的蛋白质不同。4.1.1不同的蛋白质由于分子大小、形状不同，在一定的pH条件下所带的电荷多少不同，因此在电场作用下，在凝胶中移动的快慢不同，通过电泳可以把不同的蛋白质区分开，近而区分不同的亲本和杂交4.1.2利用该电泳技术，杂交种具有不育系和恢复系的双亲谱带，双亲有差异蛋白谱带是杂交种纯度250之间细分为50等份作为标尺，50以下的部分按该标尺进行区分，读取泳道内所有蛋白指纹所处位置的数值，记为蛋白质谱带名称。图1蛋白质谱带命名示意图5仪器与试剂单粒种子磨粉器，天平(感量0.0001g,0.001g),移液管(10mL),离心管(1.5mL),离心管丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，冰醋酸，过硫酸铵，尿素，四甲基乙二胺(TEMED),三氯乙酸，考马斯亮蓝R-250,十二烷基磺酸钠(SDS),无水乙醇(所用试剂均为分析纯，所用水均为去离子水)。6溶液称取2gSDS倒入100mL烧杯中，加入去离子水溶解，加去离子水定容至100mL,转入试剂瓶，4℃贮存备用。3DB37/T3105—2018称取18g尿素，加约50mL去离子水溶解后加12mL冰乙酸，3mL四甲基乙二胺，7.5mL2%SDS,加去离子水定容至100mL,转入试剂瓶并加入0.05g甲基绿，4℃贮存备用。6.3凝胶溶液称取50g丙烯酰胺、50g尿素、1.0g甲叉双丙烯酰胺，加去离子水溶解后加入15mL冰乙酸，0.10g硫酸亚铁，加去离子水定容至500mL,6.4催化剂溶液称取1.75g过硫酸铵，加去离子水溶解并定容至50mL,4℃短期贮存。6.5电极缓冲液6.6染色液7操作程序7.1蛋白质提取7.1.1从送验样品中随机数取向日葵种子200粒，将种子去壳后用单粒种子磨粉器压碎，放入1.5mL离心管中，按向日葵种子与提取液质量体积比1:6加蛋白提取液、摇匀，25℃提取20min,用离心机4000g离心4min,取上清液备用。7.1.2与标签值比较时，为了减少工作量，可以顺序测定50粒/次，将测定结果与标签值比较是否在7.2凝胶制备将洗净晾干的玻璃板采用水平平板灌胶的方式组装玻璃板，用铁夹固定，取40mL凝胶溶液于烧杯3min聚合后将样品梳拔出，吸出样品槽中的水分，将玻璃板固定在电泳槽内。7.3点样用微量移液器取离心后的样品上清液30μL加入样品槽，每加一个样品后，用去离子水清洗移液器加样完毕后，加入2%电极缓冲液，上槽电极缓冲液要没过矮玻璃板，下槽电极缓冲液要没过玻璃7.5卸板、染色倒出电极液，卸开电泳槽并用油灰刀取出胶片，置染色液中染色12h左右。7.6电泳分析4DB37/T3105—2018亲本的为自交粒。品种粒数(M),并按式计算电泳测定值X%(保留一位小数)。X