T-CASME 1362-2024 细胞外囊泡探针分子合成技术规范

ICS07.080CCSA40CASMETechnicalspecificationsforthesynthesisofextracellularvesicleprobemoleculesIT/CASME1362—2024本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由维思克思生物科技（武汉）有限公司提出。本文件由中国中小商业企业协会归口。本文件起草单位：维思克思生物科技（武汉）有限公司、致生源健康科技（武汉）有限公司、原点生物科技（武汉）有限公司、武汉固德生物医疗科技有限公司。本文件主要起草人：付洋波、雷祖超、曾思远、宋波、李庆芳、张俊、林雷鸣。1T/CASME1362—2024细胞外囊泡探针分子合成技术规范本文件提出了细胞外囊泡探针分子合成技术的术语和定义、缩略词、基本要求、探针合成方法、标记条件验证、生物安全及防污染措施等方面的内容。本文件适用于细胞外囊泡探针分子的合成以及方法的验证。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫YY/T1441体外诊断医疗器械性能评估通用要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1细胞外囊泡extracellularvesicles一种由细胞分泌的脂质双层囊泡，包裹着细胞内的生物活性分子，具有传递信息的功能。3.2探针分子probemolecule基于N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）与氨基共价键合激发荧光基团而标记细胞外囊泡，用于细胞外囊泡在体内体外研究中准确定位和示踪。4缩略语下列缩略语适用于本文件。化合物1：1,1,2-trimethyl-1H-benzo[e]indole化合物2：3-（2-carboxyethyl）-1,1,2-trimethyl-1H-benzo[e]indol-3-ium化合物3:（E）-3-（2-carboxyethy5基本要求5.1探针分子设计原则5.1.1特异性探针分子应具有高度的特异性，能够特异性结合细胞外囊泡或其他膜结构。5.1.2亲和力探针分子应与细胞外囊泡具有适当的亲和力，以确保准确定位和示踪。5.1.3稳定性探针分子应在体内各种pH条件下保持稳定，保持较高的荧光强度。5.1.4生物相容性2T/CASME1362—2024探针分子应具有良好的生物相容性，不会对生物体或细胞产生毒性或不良影响。5.1.5可检测性探针分子应具备可检测的性质，如荧光、放射性或电化学活性等，以便于检测和定量分析。5.1.6水溶性如探针分子用于生物体液或细胞培养基等水性环境，应具有良好的水溶性。5.1.7化学稳定性探针分子应在储存和使用过程中保持化学稳定性，避免分解或变性。5.1.8反应条件设计的探针分子应考虑反应条件的兼容性，如酸碱度、温度等。5.1.9成本效益在满足需求的前提下，探针分子的设计应考虑成本效益，确保其在实际应用中的可行性。5.1.10可重复性探针分子的设计应确保其在不同实验条件下具有良好的可重复性。5.2合成路线选择和优化5.2.1合成路线的选择5.2.1.1选择的合成路线应具有可行性，包括反应条件、试剂易获得性、操作复杂度等方面的因素。5.2.1.2优先选择高产率的合成路线，以提高合成效率和经济效益。5.2.1.3选择具有高选择性的合成路线，尽量减少副反应的发生，提高目标产物的纯度。5.2.1.4考虑合成路线对环境的影响，尽量选择低污染、绿色环保的合成方法。5.2.1.5应确保合成路线在操作过程中具有较高的安全性，避免使用危险试剂或涉及高风险操作。5.2.2合成路线的优化5.2.2.1通过优化反应温度、时间、溶剂等反应条件，以提高反应效率、产率和选择性。5.2.2.2选择合适的催化剂可加速反应速率、提高选择性，并降低反应能耗。5.2.2.3尽量简化合成路线中的反应步骤，减少中间产物的合成和分离，提高整体合成效率。5.2.2.4选择适当的溶剂可以提高反应物的溶解性，促进反应进行，并便于后续的分离和纯化。5.2.2.5优化反应物的投料比，提高反应的转化率和产率。5.2.2.6优化后处理步骤，如提纯方法、结晶条件等，提高产物的纯度和收率。5.3探针合成技术综合性能评估应按照YY/T1441进行性能评估6探针合成方法6.1探针合成流程图探针合成流程图如图1所示。标引序号说明：1——1,1,2-trimethyl-1H-benzo[e]indole2——3-（2-carboxyethyl）-1,1,2-trimethyl-1H-benzo[e]indol-3-ium3——（E）-3-（2-carboxyethy3T/CASME1362—2024图1探针合成流程图6.2探针的合成6.2.1化合物2的合成6.2.1.1将1,1,2-三甲基-1H-苯并吲哚（3.13g,15.0mmoL）、3-溴丙酸（2.43g,16.0mmoL）混合于5.0mL甲苯中，氮气保护下100℃回流3h，TLC监测至反应完成。6.2.1.2将反应溶液逐渐冷却至室温后，反应液逐滴加入至乙醚（150mL）溶剂中，有大量粉末颗粒析出，经过过滤收集粉末，用冷却的乙醚（50mL）洗涤，得到绛红色固体粉末即化合物2（4.11g，产率76。HRMS（ESI,m/z）Calcd.for[C18H20BrNO2-Br-],282.1489；Found,282.1613。6.2.2化合物3的合成6.2.2.1将化合物2（722.0mg,2.0mmoL）、4-二苯胺基苯甲醛（546.0mg,2.0mmol）混合于5.0mL乙醇中，氮气保护下80℃回流9h，TLC监测至反应完成。6.2.2.2将反应溶液逐渐冷却至室温后逐滴加入至乙醚（150mL）溶剂中，有大量粉末颗粒析出，过Calcd.for[C37H33BrN2O2-Br-],537.2537；Found,537.2604。7探针标记细胞外囊泡的条件验证7.1探针标记细胞外囊泡的原理探针标记细胞外囊泡的原理如图2所示。图2探针标记细胞外囊泡的原理图7.2探针标记细胞外囊泡的过程EDC（1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）活化该探针上的羧基，促使其与NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）形成含有N-羟基琥珀酰亚胺酯的中间化合物，N-羟基琥珀酰亚胺酯再不可逆地与膜上蛋白的氨基特异性共价结合形成酰胺键，进而激发荧光基团进行显色反应。7.3探针标记参数测定7.3.1使用浓度约为50“M的探针与细胞外囊泡在室温下避光染色30min。7.3.2设置无细胞外囊泡的空白对照。7.3.3将探针与空白对照在室温避光染色30min。7.3.4通过空白对照与细胞外囊泡结合后荧光信号的增强来确认标记参数。4T/CASME1362—20247.4探针最适使用浓度的筛选7.4.1确定受试细胞（如悬浮细胞SKM1）为实验对象。7.4.2吸取约2.0×106个受试细胞（如SKM1细胞）于15mL离心管中。7.4.3用离心机离心（参数设置为5000rpm）。7.4.42%多聚甲醛室温固定15min。7.4.51%BSA/PBS封闭。7.4.6PBS重悬，均分到8个流式管中，分别使用终浓度0μM，1μM，2μM，5μM，10μM，50μM，100μM的探针于室温下避光染色30min，100mM甘氨酸中和，PBS洗涤一次，100μLPBS重悬上机检测。7.4.7与阴性对照（探针浓度为0μM）相比，使用50μM和100μM的探针标记细胞峰值偏移较大，结果应如图3所示，确定使用浓度为10μM～100μM的探针均能对细胞进行较好的标记，10μM探针在实验条件中就已经能很好区分标记细胞，满足流式检测需求。图3探针标记细胞的荧光峰值7.5不同pH对探针标记产物光谱性质的验证7.5.1以受试细胞（如悬浮细胞SKM1和KG1a）为实验对象，分别吸取约1.0×105个受试细胞（如SKM1，KG1a细胞）于15mL离心管中，2%多聚甲醛固定，均分两份，分别使用10μM的探针和10μM的常规染料CFSE在室温下对两种细胞分别避光染色30min后，等量添加至含有不同pH缓冲液的全黑96孔板中，上机检测。7.5.2与常规染料CFSE对比。新合成的探针和