医学教程 维生素的测定学习资料

维生素的测定一、概述定义维生素既不是构成机体组织的基本原料，也不是机体的供能物质，它是一类需求量极少、人体不能合成（或合成量很少）、主要以辅酶的形式参与代谢调节，是维持人体正常生命活动所必需的天然有机化合物。目前已确认的有30余种，其中被认为至关重要的有20余种。

维生素的命名

1、多根据发现的时间顺序以英文字母排序，如维生素A、维生素B1、B2，维生素C，维生素E等。

2、

也有根据特定生理功能，如抗干眼病因子、抗坏血酸、生育酚等，

3、

按照其化学结构如视黄醇、硫胺素、烟酸、叶酸等。维生素的分类1、脂溶性维生素：能溶于脂肪或脂溶剂，在食物中与脂类共存的一类维生素，包括A、D、E、K各小类，其共同特点是摄入后存在于脂肪组织中，不能从尿中排除，大剂量摄入时可能引起中毒。由于可储藏在脂肪中，故不需每天供给。2、水溶性维生素：能溶于水，包括B、C各小类，其共同特点是一般只存在于植物性食品中，满足组织需要后都能从机体排出，需要每天供给。VA17－脱氢胆固醇

麦角固醇

生育三烯酚生育酚

β－胡萝卜素VA2维生素D3(胆钙化醇)

测定食品中维生素的含量的意义

1、在评价食品的营养价值，2、

寻找富含维生素的食品资源，3

指导人们合理调整膳食结构，防止维生素缺乏症或维生素中毒，4、

研究维生素在食品加工、贮存等过程中的稳定性，指导人们制定合理的工艺及贮存条件，5、监督维生素强化食品的强化剂量，防止因摄入过多而引起维生素中毒维生素的分析方法生物鉴定法：费时、费力、需要动物饲养场地微生物法：仅限于水溶性维生素的测定荧光法：用于硫胺素的测定仪器法：快速、灵敏、有较好的选择性HPLC：用于大多数维生素的测定，费用高二、脂溶性维生素的测定脂溶性维生素的理化性质溶解性：脂溶性维生素不溶于水，易溶于苯、乙醚、丙酮、三氯甲烷、乙醇等有机溶剂。耐酸碱性：维生素A、D对酸（ACID）不稳定，对碱稳定；维生素E在无氧情况下，对热、酸、碱稳定。维生素K对酸、碱都不稳定。耐热、耐光、耐氧化性：

维生素A、D、E、K耐热性都好，维生素D性质稳定，不易被氧化。维生素A易被氧化，光和热会促进其氧化。维生素E容易被氧化，对可见光稳定但易被紫外线破坏。维生素K对热稳定，但容易被光、氧化剂及醇破坏。（这样在提取时，要求尽量避光、并加入抗氧化剂）

脂溶性维生素提取的一般步骤及注意事项步骤：

1、取样（如鱼肝）

2、加乙醇研磨或匀浆机均质化（常加入抗氧化剂（如焦性没食子酸，抗坏血酸等））

3、加碱加热皂化（Vk除外）（使脂肪水解成脂肪酸进而形成水溶性的脂肪酸盐）

4、水洗去除脂肪酸盐

5、从水洗后的残渣中用有机溶剂提取脂溶性维生素

6、必要时进行减压回旋蒸发浓缩7、HPLC分析注意事项：1、

在皂化和浓缩时，为防止维生素的氧化分解，加入抗氧化剂2、

对于某些含脂肪量低、脂溶性维生素含量较高的样品，可以先用有机溶剂抽提，然后皂化，再提取。3、

对于那些对光敏感的维生素，分析操作一般需要在避光条件下进行。一.高效液相色谱法（HPLC）测定食物中维生素A、E的含量（一）原理样品中维生素A及维生素E经皂化提取处理后，将其从不可皂化部分提取至有机溶剂中。用高效液相色谱法C18反相柱将维生素A和维生素E分离，经紫外检测器，用内标法定量测定（二）样品处理1.皂化称取适量样品（含维生素A约3μg，维生素E各异构体约40μg）于三角瓶中，加30mL无水乙醇，振摇使样品分散。加入5mL100g/L抗坏血酸溶液和2.00mL苯并[e]芘溶液（5μg/L，内标用），混匀，加10mL氢氧化钾溶液（50％浓度），混匀，于沸水浴上回流30min，使皂化完全，皂化后立即放入冰水中冷却。2.提取将皂化后的样品移入分液漏斗中，用50mL水分2－3次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用100mL无水乙醚分2次洗皂化瓶及残渣，乙醚液并入分液漏斗中。轻轻振摇分液漏斗2min，静置分层，弃去水层。然后每次用约100mL水将乙醚液洗至中性，约4－5次3.浓缩将乙醚提取液经无水硫酸钠（约5g）滤入150mL旋转蒸发瓶内，用约15mL乙醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠2次，并入蒸发瓶内，于55℃水浴中减压蒸馏并回收乙醚，待瓶中乙醚剩下约2mL时，取下蒸发瓶，用氮气吹干乙醚，随即加入2mL乙醇，充分混合、溶解提取物。将乙醇液移入塑料离心管中，于离心机上离心5min（3000r/min），上清液供色谱分析用。（三）液相色谱分析色谱推荐条件：预柱：ODS10μm,4mm×4.5cm分析柱：ODS5μm,4.6mm×25cm流动相：甲醇：水＝98：2，混匀，临用前脱气。紫外检测器波长：300nm,量程0.02进样量：20μL流速：1.65～1.70mL/min(四)计算X=ρ/m×V×100/1000式中

X-某种维生素的含量，mg/100g;ρ-由标准曲线上查到某种维生素含量，μg/mL；V–样品浓缩定容体积，mL；m–样品质量，g。二、比色法测定维生素A的含量（一）原理维生素A在三氯甲烷中与三氯化锑相互作用，产生蓝色物质，其深浅与溶液中所含维生素A的含量成正比，在620nm波长下测定其吸光度。（二）测定方法1．样品处理维生素A极易被光破坏，实验操作应在微弱光线下进行。根据样品性质，可采用皂化法或研磨法。称取0.5～5g样品于锥形瓶中，加入10mL50％氢氧化钾溶液及20～40mL乙醇，于电热板上回流30min，至皂化完全。将皂化瓶内混合物移至分液漏斗中，用无水乙醚充分洗涤皂化瓶，洗液并入分液漏斗内，将水层与乙醚层分开，水层反复用乙醚抽提直至无维生素A为止。合并醚层后，先用水洗提后，再用0.5mol/L氢氧化钾溶液洗涤除去醚溶性酸皂，再用水洗涤醚层，直至洗涤水不呈碱性（用酚酞指示剂）为止。将醚层放出，经过无水硫酸钠脱水后，蒸馏浓缩至剩下5mL乙醚时减压抽气至干，立即加入一定量的三氯甲烷使溶液中维生素A含量在适宜范围内，供比色测定。2．标准曲线制备准确取一定量维生素A标准溶液于4～5个容量瓶内，用三氯甲烷配置标准系列。再取相同数量比色管顺次取1mL三氯甲烷和标准系列使用液1mL，各管加入乙酸酐1滴，制成标准系列，于620nm波长处，以三氯甲烷调节零点，将标准比色系列按顺序移入光路前，迅速加入9ml三氯化锑－三氯甲烷溶液，于6s内测定吸光度，绘制标准曲线。3．样品测定于一比色管中加10mL三氯甲烷，1滴乙酸酐为空白液，另一比色管中加入1mL三氯甲烷，其它比色管分别加入1mL样品溶液及1滴乙酸酐，以下步骤同标准曲线的制备。（三）计算x=ρ/m×v×100/1000式中：x－样品中维生素A含量，mg/100g（如按国际单位，1IU＝0.3ug维生素A）；ρ－由标准曲线上查得维生素A的含量，ug/mL；m－样品质量，g；v－抽取后加三氯甲烷定量的体积，mL；（四）讨论1．本法摘自GB12388－90，适用于食品中维生素A的测定。2．三氯化锑有腐蚀性，不能粘在手上，三氯化锑与水能生成白色沉淀，所以不能碰到水。3．三氯化锑与维生素A生成的蓝色物质很不稳定，要在6s内完成吸光度的测定，否则蓝色反应逐渐消失，使结果偏低。三、水溶性维生素的测定水溶性维生素:1、

水溶性维生素包括维生素B族(维生素B1(硫胺素)、维生素B2（核黄素）、维生素B6（吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺）、维生素PP（烟酸）、叶酸、泛酸（维生素B3）、生物素（维生素B7）)维生素C(抗坏血酸)和硫辛酸，广泛存在于动植物组织中，常以辅酶的形式存在。2、都易溶于水，而不溶于苯、乙醚、氯仿等大多数有机溶剂。3、在酸性介质中很稳定，即使加热也不破坏；但在碱性介质中不稳定，如果同时加热，更易于破坏或分解。

4它们易受空气、光、热、酶、金属离子等的影响(如维生素B2对光，特别是紫外线敏感，易被光线破坏；维生素C对氧、铜离子敏感，易被氧化)。测定水溶性维生素的一般方法样品处理：一般多在酸性溶液中进行前处理，再经淀粉酶、木瓜蛋白酶等酶解作用，使结合态维生素游离出来，再进行提取。为进一步去除杂质，还可用活性人造沸石、硅镁吸附剂等进行纯化处理。测定水溶性维生素的方法常有高效液相色谱法、荧光比色法、比色法和微生物法等。水溶性维生素的测定举例维生素B1的测定(THIAMINE)

维生素B1又称抗神经炎素，因其分子中既含有氮（N），又含有硫（S），故又称硫胺(素)。特别是在酸性介质中相当稳定。但在碱性介质中对热极不稳定。

硫胺素在碱性介质中可被铁氰化钾氧化产生硫色素，在紫外光照射下产生蓝色荧光，可借此以荧光比色法定量。硫胺素能与多种重氮盐偶合呈现各种不同颜色，借此可用比色法测定。比色法灵敏度较低，准确度也稍差，适用于含硫胺素高的样品。荧光法和高效液相色谱法灵敏度很高，是目前常用的方法。荧光法

这里我们主要介绍荧光法

参考GB/T5009.84-2003食品中硫胺素(维生素B1)的测定

方法原理试样在酸性溶液中加热，提取维生素B1，经蛋白分解酶处理，使维生素B1成为游离型。再经层析柱纯化，去除荧光淬灭物质，同时浓缩，用碱性铁氰化钾溶液将其氧化成硫色素，在紫外线下，硫色素发出荧光，再给定的条件下以及没有其他物质干扰时，此荧光之强度与硫色素量成正比即与溶液中维生素B1量成正比。操作步骤1.样品处理样品采集后用匀浆机打成匀浆于低温冰箱中冷冻保存，用时将其解冻后使用。

2.样品提取3.净化a.脱脂棉铺于盐基交换管的交换柱底部，再加约1g活性人造浮石使之达到交换柱的1/3高度。b.用移液管加入提取液20~60ml。c.加入约10ml热蒸馏水冲洗交换柱，弃去洗液，重复三次。d.加入20ml50g/L酸性Kcl,收集此液于25ml刻度试管内。凉至室温，用250g/L酸性Kcl定容至25ml，即为净化液。

做空白试验重复上述操作，将20ml维生素B1标准使用液加入盐基交换管以代替试样提取液，即得到标准净化液。4.氧化

将5ml试样净化液分别加入A、B两个反应瓶；同时将5ml标准净化液分别加入A1、B1两个反应瓶中。Maizel-Gerson

反应瓶氧化流程反应瓶要同时振摇，准确计时90s.5、测定

荧光测定条件：

激发波长365nm；发射波长435nm；激发波狭缝5nm；发射波狭缝5nm。

依次测定下列荧光强度：

a.样品空白荧光强度（样品反应瓶A）；

b.标准空白荧光强度（标准反应瓶A1）；

c.样品荧光强度（样品反应瓶B）；

d.标准荧光强度（标准反应瓶B1）；

6.计算式中：X──样品中硫胺素含量，mg/100g；

U──样品荧光强度；

Ub──样品空白荧光强度；

S──标准荧光强度；

Sb──标准空白荧光强度；

c──硫胺素标准工作液浓度，μg/ml；

V──用于净化的硫胺素标准工作液体积，ml；

V1──样品水解后定容之体积，ml；

V2──样品用于净化的提取液体积，ml；

m──样品质量，g；

试剂作用1、蛋白分解酶：用于试样的蛋白分解。2、盐酸：水解样品。3、氯化钾：该热溶液可从盐基交换管中的浮石里解析出维生素B1。4、铁氰化钾碱性溶液：氧化游离的维生素B1，生成硫色素。5、正丁醇：溶解紫外荧光物质——硫色素试剂。注意事项

1、加热酸性Kcl时不能使其沸腾，热Kcl滤速较快，而不沸则是使其不至因过饱和而在洗涤中结晶析出阻塞交换柱。

2、紫外线会分解破坏维生素B1，所以维生素B1形成后要快速测定。

3、氧化中加铁氰化钾是整个实验的关键，对每个样品所加试剂的次序、快慢、振摇时间等都必须尽量一致，尤其是用正丁醇提取硫色素时必须保证准确振摇90s。维生素C的测定维生素C又名抗坏血酸，自然界存在的有L－型、D－型两种，D－型的生物活性仅为L－型的1/10。维生素C广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜中含量都很丰富。维生素C具有较强的还原性，对光敏感，氧化后的产物称为脱氢抗坏血酸，仍然具有生理活性，进一步水解则生成2，3－二酮古乐糖酸，失去生理作用。食品分析中的所谓总抗坏血酸是指抗坏血酸和脱氢抗坏血酸二者的总量，不包括二酮古乐糖酸和进一步的氧化产物。

还原型抗坏血酸脱氢抗坏血酸2，3－二酮古乐糖酸氧化氧化（－）适用类别固蓝盐比色法适用于还原型抗坏血酸含量测定。（二）实验原理在乙酸溶液中，抗坏血酸与固蓝盐B反应生成黄色的草酰肼-2-羟基丁酰内酯衍生物。可在其最大吸收波长（420nm）处测定吸光度，与标准系列比较定量。

（三）仪器与试剂1．试剂（1）2mol／L乙酸溶液吸取11.6mL冰醋酸，加水稀释至100mL。（2）0.5mol／L乙酸溶液吸取29mL冰醋酸，加水稀释至100mL。（3）0.25mol／L乙二胺四乙酸二钠溶液称取9.3g乙二胺四乙酸二钠（C10H14N2O8Na2·2H2O）加水并加热使之溶解，冷却并稀释至100mL。（4）蛋白质沉淀剂①乙酸锌溶液称取22.0g乙酸锌［Zn（CH3COO）2·2H2O］，加3mL冰醋酸溶于水并稀释至100mL。。②亚铁氰化钾溶液称取10.6g亚铁氰化钾［K4Fe（CN）6·3H2O］，加水溶解至100mL。

（5）显色剂固蓝盐B（FastBlueSaltB）溶液准确称取0.2g固蓝盐B，加水于100mL棕色容量瓶中定容。该溶液在室温下贮存可稳定3d以上。（6）抗坏血酸标准储备溶液精密称取0．2000g抗坏血酸，加20mL2mol／L乙酸溶液，溶解后移入100mL棕色容量瓶中，用水定容并混匀。此溶液相当于2.0mg／mL抗坏血酸（10℃下冰箱内贮存可稳定2d）。（7）抗坏血酸标准使用溶液用移液管精密吸取5.0mL抗坏血酸标准储备溶液于100mL棕色容量瓶内。加5mL2mol／L乙酸溶液并用水定容。此溶液相当于100μg／mL抗坏血酸（临用时配制）。2．仪器可见光分光光度计；捣碎机；离心机。（四）实验步骤1．样品溶液的制备（1）非蛋白性食品①液体试样抗坏血酸含量在0.2g／L以下的试样，混匀后可直接取样测定；抗坏血酸含量0.2g／L以上的试样，用水适当稀释后测定。②水溶性固体试样准确称取1.0～5.0g，精确至0.001g，加5mL2mol／L乙酸溶液研磨溶解后，移入100mL棕色容量瓶内，加水定容。③蔬菜、水果样品称取鲜样可食部分20.00～50.00g，加等量的2mol／L乙酸溶液用捣碎机捣成匀浆。称取10.0～20.0g匀浆于100mL棕色容量瓶内，加5mL2mol／L乙酸溶液，用水定容，过滤备用。不易过滤的样液可用离心机离心分离，上清液供测定用。

（2）蛋白性食品固体试样混匀后精密称取5.0～10.0g，精确至0001g；液体试样用移液管精密吸取5.0～10.0mL于100mL棕色容量瓶内。加10mL2mol／L乙酸溶液，乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液各75mL，加水定容。将全部溶液移入离心管内，以3000r／min离心10min，上清液供测定用。同时取与处理试样相同量的乙酸溶液、乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液，按同一方法做试剂空白对照。2．标准曲线绘制取一套10mL比色管，编号，按表3－12加入各试剂。试剂配加表各管加水稀释至10mL，混匀并在室温下放置20min后，用1cm比色皿，以零号管为参比，于420nm处测定吸光值。以抗坏血酸含量为横