DB37T 2841-2016 鸭坦布苏病毒半套式RT -PCR检测方法

DB37DB37/T2841—2016鸭坦布苏病毒半套式RT-PCR检测方法山东省质量技术监督局发布IDB37/T2841—2016本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东农业大学。本标准主要起草人：刁有祥、唐熠、陈浩、冯强、提金凤。1DB37/T2841—20161范围2.1仪器3.1试剂3.1.2rTaqDNA聚合酶(5U/μL);3.1.6dNTPs(2.5mmol/L,10mmol/L);3.1.81.5%琼脂糖凝胶，见A.1;3.1.10溴化乙锭(10μg/μL),见A.3;3.1.11核酸电泳加样缓冲液，见A.4;3.1.12商品化的DNA分子量标准，要求在100bp~2000bp之间，有5条以上的指示条带；2DB37/T2841—2016检测所需引物下游内侧引物5371R:5'-CCAAAGTTGGCYCCCATCTC-3’;下游外侧引物5861R:5'-AGCACACGGCAATCTCAT-3’,扩增片段长度为277bp。4操作程序死亡鸭采集卵泡膜、脾和脑等组织样品，进行分别处理或同时处理；活鸭采集咽喉或泄殖腔拭子。样品应放在含有抗生素的pH值7.0~7.4的等渗磷酸盐缓冲液(PBS,附录B.1)内(无PBS可用25%~7.0~7.4。在室温放置1h~2h内样品应尽快处理，不能处理的可在4℃存放24h,也可于低温条件下酸盐缓冲液中；研碎的组织用含抗生素pH值7.0~7.4的等渗PBS溶液配成10%～20%(g/mL)的悬液。样4.2对照设置每次检测，用相应的阳性对照标准品和阴性对照标准品，至少设置一个或一个以上的阴性对照和阳性对照。4.3RNA提取按照RNA提取试剂盒说明书，提取样品和对照的RNA。提取的RNA应随时检测，否则应于-70℃冻存。μL,M-MLV反转录酶1μL,共10μL。3DB37/T2841—20164.6PCR反应4.6.1第一次PCR反应10×PCRBuffer2.5μL,dNTPs(2.5mmol/L)2μL,引物5455F(100μm4.6.1.2PCR反应条件94℃预变性5min;94℃30s,50℃30s,72℃30s,进行30个循环；72℃延伸5min。4.6.2.1套式PCR反应体系10×PCRbuffer2.5μL,dNTPs(2.5mmol/L)2μL,引物5455F(100μmol/L)和5731R(100μmol/L)4.6.2.2PCR反应条件94℃预变性5min,94℃30s,50℃30s,72℃30s,进行30个循环；72℃延伸5min。。4.7套式PCR产物电泳套式PCR反应结束后，取9μL样品与1μL核酸电泳加样缓冲液混匀后，于1.5%琼脂糖凝胶中电泳，时，每隔10min观察一次。当加样缓冲液中溴酚蓝电泳过半至凝胶下2/5处时，可停止电泳)。电泳后，4.8结果判定阳性对照出现相应大小的扩增条带，且阴性对照无此扩增条带时，判定检测有效；否则判定检测结坦布苏病毒半套式PCR产物的大小为277bp。如果在阳性对照出现277bp扩增条带，阴性对照无条带出现(引物二聚体除外)时试验成立。被检样品出现277bp条带为坦布苏病毒阳性，否则为阴性(附4(规范性附录)相关试剂的配制A.11.5%琼脂糖凝胶的配制琼脂糖1.5g0.5×TAE电泳缓冲液加至100mL微波炉中完全融化，待冷至50℃~60℃时加入溴化乙锭(EB)溶液5μL,摇匀。倒入电泳板上，凝固后，取下梳子，备用。A.21×TAE电泳缓冲液的配制A.2.1配制0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na₂)溶液(pH8.0)mL乙二胺四乙酸二钠mL灭菌双蒸水mL氢氧化钠调pH至灭菌双蒸水加至mL用于配制A.2.2中的50×TAE电泳缓冲液A.2.2配制50×TAE电泳缓冲液羟基甲基氨基甲烷(Tris)冰醋酸0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na₂)溶液(pH8.0)灭菌双蒸水加至A.2.3配制1×TAE电泳缓冲液50×TAE电泳缓冲液灭菌双蒸水加至A.3溴化乙锭的配制溴化乙锭灭菌双蒸水加至20mgA.4核酸电泳加样缓冲液(10×)聚蔗糖灭菌双蒸水242100gmLmLmL5DB37/T2841—2016溴酚蓝二甲苯青6DB37/T2841—2016附录B(规范性附录)试剂的配制Na₂HPO₄·12H₂OKH₂PO₄双蒸馏水加