细胞增殖分子基础课件

细胞增殖的分子基础

--易静11.细胞增殖分子基础细胞增殖

cellproliferation

发生在哪些生命现象中？

个体发育，组织更新，创伤修复11.细胞增殖分子基础胚胎发育动画个体发育(胚胎和成体)中的细胞行为-增殖、分化、凋亡、迁移、黏附出生前生长发育：

Lifebeganasaself-replicatingstructure出生后生长发育：11.细胞增殖分子基础为什么肠上皮细胞需要频繁更替而大多数神经元却终身不更替？

哪些细胞需要频繁更替、哪些偶尔更替、哪些永不更替？小肠上皮更新动画组织更新、机体自稳中的细胞行为-增殖、分化、凋亡、迁移、黏附成体：11.细胞增殖分子基础为什么培养细胞划痕后发生增殖和迁移？

体内组织的损伤修复再生是否有同样的机制？疤痕问题培养细胞划痕后增殖迁移动画创伤修复中的细胞行为-增殖、分化、凋亡、迁移、黏附11.细胞增殖分子基础细胞增殖

发生在个体发育组织更新创伤修复增殖-最重要的细胞生理活动过程?关键分子？调控?11.细胞增殖分子基础能在一群细胞中认出处于分裂期不同阶段的细胞吗？间期末期后期中期前期卡通细胞周期各期的主要特征M期：形态变化间期：生化变化11.细胞增殖分子基础细胞增殖中的一些关键问题细胞如何准确地复制遗传物质及传给子细胞的？推进细胞周期的关键分子是什么？细胞增殖是如何被机体调控的？11.细胞增殖分子基础如何研究细胞周期？

1显微镜观察细胞周期

体细胞周期分为G1、S、G2、M期

M期分为前、前中、中、后、末期和胞质分裂

举例：胚胎细胞分裂2荧光标记或免疫荧光，显示有丝分裂的动态过程和分子变化DNA合成(S):3H-胸腺嘧啶脱氧核苷标记3不同的系统提供多样的方法来鉴定和分离细胞周期因子11.细胞增殖分子基础显微镜观察细胞周期间期分裂前期分裂中期分裂后期分裂末期11.细胞增殖分子基础体细胞周期分为G1、S、G2、M期间期1(G1)间期2(G2)DNA合成(S):3H-胸腺嘧啶脱氧核苷标记有丝分裂(M):染色体凝缩-形态学11.细胞增殖分子基础M期分为前、前中、中、后、末期和胞质分裂前期prophase前中期prometaphase中期metaphase末期telophase后期anaphase胞质分裂cytokinesis11.细胞增殖分子基础胚胎细胞分裂-很多胚胎细胞分裂迅速(10-15分钟)受精卵来自于非洲蟾蜍，果蝇，海胆，蛤-交替的S期和M期（几乎没有G1和G2）。-使用卵内存储蛋白进行有丝分裂（不必进行转录和翻译），直至用完。11.细胞增殖分子基础荧光标记或免疫荧光，显示有丝分裂的动态过程和分子变化11.细胞增殖分子基础不同的系统提供多样的方法来

鉴定和分离细胞周期因子-培养的哺乳动物细胞(-RaoandJohnson)芽殖酵母(Saccharomyces

cerevisiae-LelandHartwell)-裂殖酵母(Schizosaccharomyces

pombe-PaulNurse)

蛙卵母细胞(Xenopuslaevis,Ranapipiens-YoshioMatsui)海胆和蛤卵(-JoanRuderman&TimHunt)11.细胞增殖分子基础问题系列一.所有细胞增殖周期的运转是否依赖统一的分子装置驱动？

molecularmachinery问题1.

有没有？11.细胞增殖分子基础间期与分裂期的哺乳动物细胞HeLa11.细胞增殖分子基础11.细胞增殖分子基础M期细胞M期细胞M期细胞S期细胞G1期细胞G2期细胞11.细胞增殖分子基础非洲蟾蜍卵母细胞成熟与激活成熟激活G2卵母细胞减数分裂1期减数分裂间期停留在减数分裂中期的卵受精卵第一次有丝分裂YoshioMatsui11.细胞增殖分子基础MPF测定

(YoshioMatsui)细胞质转移11.细胞增殖分子基础11.细胞增殖分子基础Maturationpromotingfactor(MPF)

是有丝分裂和减数分裂共同的调节因子

来源于胚胎细胞或者体细胞以及成熟卵细胞MPF，

具有相同的生物学功能

受精11.细胞增殖分子基础问题2.MPF的生化形式是什么？

卵裂解液过层析柱分析，第二个柱就消失了…十几年时间，使用大量卵，仅能获得少量纯化的MPF！遗传学家（Hartwell、Nurse）找到了简单的系统--酵母。酵母优点：天然存在多种突变体，如温度敏感突变体；生长停滞于特定阶段，可供获得各种表型的细胞分析相关基因问题系列一.所有细胞增殖周期的运转是否依赖统一的分子装置驱动？molecularmachinery

11.细胞增殖分子基础2001年诺贝尔生理医学奖得主

--关于细胞调节周期LelandHartwellPaulNurseTimHunt11.细胞增殖分子基础Hartwell:通过单细胞芽殖酵母发酵分离细胞周期相关基因（cdc）突变体分离不同条件下的芽殖酵母突变体,主要是引起细胞生长停止以及形态畸形的温度敏感突变体(ts)。11.细胞增殖分子基础分离酵母条件突变体高温突变体:25oC下能够生长，37oC下不能生长培养的酵母细胞采用EMS或其他化学物质突变25oC许可问题下生长(许可温度)复制平板培养37oC下无法生长的突变体(非许可温度)突变体终止分裂表型:小芽,哑铃状,无DNA合成等。11.细胞增殖分子基础芽酵母菌的cdc突变体G1(Start)突变体:cdc28,cdc4,cdc6,cdc7,etc.S期突变体:cdc21,cdc46,etc.有丝分裂:cdc5,cdc14,cdc15,etc.11.细胞增殖分子基础分离酵母cdc突变体的编码基因质粒库中的酵母基因组DNA(酵母筛选和E.coli大肠杆菌药物抗性标记)置入突变酵母感受态突变体细胞转化在特定温度和酵母筛选培养基上生长(25oC)25oC37oC分离质粒，拿到基因11.细胞增殖分子基础PaulNurse:从裂殖酵母中分离cdc突变体S.pombeG1期短，G2期长；生长是变长的过程，如果阻滞于M期，细胞停留于长的形态。停留在G2/M的cdc突变体被分离:cdc2,cdc25,cdc13,etc.11.细胞增殖分子基础S.pombecdc2突变体G2期细胞有丝分裂后期细胞分裂Cdc2突变：G1期(start启动)、G2期和M期缺陷G1期细胞S期G2期有丝分裂后期细胞分裂11.细胞增殖分子基础cdc2tscdc2tsCDC2

质粒突变体突变体转染野生型质粒拯救11.细胞增殖分子基础野生型细胞cdc2ts

细胞cdc2ts

细胞+人类CDC2

质粒11.细胞增殖分子基础S.PombeCDC2：

一种保守的丝氨酸/苏氨酸激酶-裂殖酵母CDC2基因能够拯救cdc2G2/M停滞表型。-裂殖酵母

（S.pombe）cdc2突变体也可被芽殖酵母(S.cerevisiae)

cdc28或人类CDC2基因拯救。CDC2=CDC28;CDC2/CDC28调节G1和G2/M。11.细胞增殖分子基础CDC2是MPF活性的一部分非洲蟾蜍MPF

注射卵母细胞卵母细胞成熟(减数分裂)非洲蟾蜍MPF通过p13SUC1亲和柱吸收注射卵母细胞卵母细胞成熟(减数分裂)p34=CDC2;另一种蛋白~50-60

kDa?(酵母p13SUC1

结合酵母和动物CDC2)Matsui小组终于纯化证明11.细胞增殖分子基础TimHunt发现细胞周期蛋白精子海胆卵受精

1stS-期1st有丝分裂2ndS-期2nd有丝分裂蛋白质合成:ABA=cyclinA（p50），B=cyclinB（p60）11.细胞增殖分子基础细胞周期蛋白和MPF生物学行为相同-MPF活性波动;细胞周期蛋白含量波动-MPF具有激酶活性-MPF包含CDC2和其他成分MPF=cyclinB(cyclinA)+CDC211.细胞增殖分子基础细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)的功能

CyclinA/BCDC2DNA复制染色体凝缩活化的CDC2激酶复合体核膜解聚有丝分裂纺锤体形成Anaphase-promotingcomplex/Cyclosome(APC/C)有丝分裂后期cyclinAandcyclinB蛋白水解作用使得CDC2失活，并且引起有丝分裂的中止。染色体进一步凝缩11.细胞增殖分子基础问题3.CDC2是如何被调控的？

问题系列一.所有细胞增殖周期的运转是否依赖统一的分子装置驱动？molecularmachinery

11.细胞增殖分子基础CyclinA: S期，可能G2期CyclinB: M期CyclinE: G1/S过渡CyclinD: G1期CyclinD和CyclinE被称为G1cyclinCyclinB被称为Mcyclin哺乳动物细胞周期蛋白水平最高时期各种周期蛋白在细胞周期中的水平差异11.细胞增殖分子基础周期蛋白:周期性地表达增多和减少11.细胞增殖分子基础问题：1、CyclinA/B含量在间期并非完全没有，但为什么没有作用？2、周期性出现的cyclin如何知道与相应的CdK结合？如：在M期，CDC2如何与CyclinA/B结合？11.细胞增殖分子基础PaulNurse的工作：Wee1和CDC25野生型S.pombecdc25,cdc13,cdc2功能丧失型突变体细胞大小wee1和cdc2功能获得型突变体A.B.C.失活CDC2激活CDC2/CDC13CDC25WEE1CDC13CDC13=cyclinBWee：小咪咪（PaulNurse苏格兰人）11.细胞增殖分子基础Y=酪氨酸;T=苏氨酸CDC2被磷酸化调节WEE1：激酶CDC25：磷酸酶WEE1在S期结束时发出要激活CDC2的信号给CDC25实验证据：11.细胞增殖分子基础WEE1和CDC25合作,将CDC2激活耦合到G2/M期CDC2Y15-PO4失活的CDC2Sphase细胞WEE1激酶CDC2Y15CDC25磷酸酶激活的CDC2G2和有丝分裂细胞CDC2Y15CDC2F15激活的CDC2对WEE1不敏感细胞在S期分裂细胞只在有丝分裂中分裂Y15F突变体WT11.细胞增殖分子基础CDC2

(=人类cyclin-dependentkinase1,CDK1)的调节CDC25自身：通过磷酸化和蛋白降解调节11.细胞增殖分子基础LeeHartwell的工作：

芽殖酵母S.cerevisiae的CDC28CDC28调节G1和G2期但多数cdc28突变体在G1期(Start)就停滞CDC28G1SG2/M？？?11.细胞增殖分子基础芽殖酵母S.cerevisiaeCDC28

通过与不同的细胞周期蛋白结合，对G1,S和G2/M进行调节CDC28Cln1Cln2Cln3G1进展营养以及细胞大小G1SClb5Clb6G2/MClb1Clb2Clb3Clb4S期进展G2和有丝分裂S期checkpointCDC28=裂殖酵母CDC2和人类CDK111.细胞增殖分子基础哺乳动物细胞中的周期各期CDKs哺乳动物细胞具有多种细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs):CDC2/CDK1: 只有G2/MCDK2: G1/S和G2CDK3: 可能类似于CDK2但水平非常低CDK4&CDK6: G1CDK5: 在神经元/神经系统起主要作用11.细胞增殖分子基础cyclin调节亚单位

cyclin-Cdk复合物Cdk催化亚单位一系列cyclin-Cdk复合物构成细胞周期运转的驱动力11.细胞增殖分子基础触发有丝分裂触发DNA复制M-cyclinG1-cyclin11.细胞增殖分子基础影响Cdk活性的核心因素发动机加速器制动器Cyclin-CdKCdk与cyclin结合Cdk的磷酸化或去磷酸化cyclin受调降解Cdk抑制因子Cdk的磷酸化或去磷酸化Cdk-cyclin：统一的分子装置，发动机11.细胞增殖分子基础

哺乳动物细胞周期和CKICDKinhibitors,又简称CKI11.细胞增殖分子基础哺乳动物细胞CKI-Ink4家族CDK4

inhibitor/Ink4家族:

p16Ink4a,p15Ink4b,p18Ink4c,andp19Ink4d:-只和CDK4或CDK6结合-抑制cyclinD/CDK4/6活性Thep16Ink4A

基因定位在染色体9p21,它的缺失和家族性黑素瘤和胰腺肿瘤有关作为与CDK4相互作用的蛋白被分离11.细胞增殖分子基础哺乳动物细胞CKI-

p21/p27家族p21Cip1,p27Kip1,和p57Kip2:-结合到G1cyclins二元复合体:cyclinD/CDK4/6,cyclinE/CDK2-也可以结合到cyclinA/CDK2和cyclinB/CDC2-作为与CDK2结合的蛋白被分离11.细胞增殖分子基础问题4.

CKI自身如何被调控？1、Ink4家族p16与cyclin竞争性地结合CDK4/62、p27家族p27突然降解，细胞进入S期

p27knock-out:小鼠器官变大问题系列一.所有细胞增殖周期的运转是否依赖统一的分子装置驱动？molecularmachinery

11.细胞增殖分子基础G1晚期CDK抑制因子p27降解

促使进入S期p27蛋白水平CyclinCDKp27CyclinCDKG0/G1G1晚期S期G2/MG1CyclinECyclinA/Bp27p27CyclinD11.细胞增殖分子基础E1E2E326Sproteosome底物eNH2ATP泛素泛素-依赖性的蛋白水解底物特异性由E3决定11.细胞增殖分子基础SCF(SKP1,CUL1,Fox-蛋白)：泛素E3连接酶复合物

SKP1FBSKP2(F-box蛋白)LRRCUL1ROC1SKP2: 底物结合特异性蛋白

底物结合E211.细胞增殖分子基础G1晚期CDK抑制因子p27降解

促使进入S期p27蛋白水平CyclinCDKp27CyclinCDKG0/G1LateG1SphaseG2/MG1CyclinECyclinA/Bp27CyclinDSKP2p27G1晚期CDK抑制因子p27经泛素－蛋白酶体途径降解，

促使进入S期11.细胞增殖分子基础p19(SKP1)和p45(SKP2)作为

cyclin相关蛋白从肿瘤细胞中被分离SKP:S期激酶相关蛋白通过蛋白组学方法发现**非肿瘤细胞11.细胞增殖分子基础所有细胞增殖周期的运转是否依赖统一的分子装置驱动？molecularmachinery

抑癌基因抑癌基因是正常细胞增殖过程中的负调控因子，它编码的蛋白质往往起阻止细胞周期进程的作用，其功能与癌基因相拮抗。p53、Rb等问题5.

还有哪些负调控者？问题系列一.11.细胞增殖分子基础抑癌基因Rb和p53与人类癌症生殖细胞突变体细胞突变Rbrbrbrb(AlfredKnudson)视网膜细胞瘤(age13-18)２次突变11.细胞增殖分子基础遗传性视网膜母细胞瘤：儿童发病，双侧受累11.细胞增殖分子基础视网膜母细胞瘤基因

Rb的正常功能：调节细胞周期，

(非磷酸化的活化状态)

对G1-S发生抑制11.细胞增殖分子基础p53功能正常DNA损伤DNA损坏的细胞无法增殖维持基因组稳定性阻止细胞周期进展诱导细胞凋亡p53功能丧失DNA损坏的细胞增殖基因组失去稳定性细胞逃脱凋亡细胞周期进展不受阻11.细胞增殖分子基础P53介导增殖阻滞和DNA修复DNA-PK:DNA-dependentproteinkinaseATM:AtaxiaTelangiectasiaMutatedATR:ATandRad3-relatedproteinkinase11.细胞增殖分子基础Schematicrepresentationofthedifferentapoptoticpathwayscontrolledbyp53.

Theactivityofp53iscontrolledindifferentwaysdependingonthecellcontext:post-translationalmodifications,cofactorsandinhibitors)CellDeathandDifferentiation(2003)10,397–399p53:25yearsofresearchandmorequestionstoanswer3P53介导凋亡11.细胞增殖分子基础问题6.

还有哪些正调控者？生长因子，癌基因问题系列一.所有细胞增殖周期的运转是否依赖统一的分子装置驱动？molecularmachinery

11.细胞增殖分子基础生长因子细胞表面相应受体触发一系列信号传递反应激活细胞周期控制系统，相应调节蛋白产生调控细胞周期的进行表皮生长因子、转化生长因子等,它们的受体.下游分子等生长因子信号途径和癌基因11.细胞增殖分子基础细胞质细胞核活化细胞周期控制系统生长因子生长因子对细胞周期的影响11.细胞增殖分子基础基因突变造成所编码的受体异常染色体易位造成所编码的激酶异常持续激活11.细胞增殖分子基础各种信号通过影响cyclin-Cdk间接影响细胞周期发动机加速器制动器Cyclin-CdKCdk与cyclin结合Cdk的磷酸化或去磷酸化cyclin受调降解Cdk的磷酸化或去磷酸化Cdk抑制因子生长因子；癌基因抑癌基因11.细胞增殖分子基础问题系列二细胞如何准确地复制遗传物质及传给子细胞的？DNA分子方面的保障机制细胞调控的环节：复制的准确性、完整性、修复分配的准确性--mitoticspindleassembly,sisterchromosomeseparation,checkpoints…--replicationorigins,telomeres,centromere,kinetochore11.细胞增殖分子基础问题1.

为什么DNA在周期中只复制一次？问题系列二细胞如何准确地复制遗传物质及传给子细胞的？11.细胞增殖分子基础复制许可（licensing）CDKs,CDC7ORC:OriginRecognitionComplexM:MCMproteins11.细胞增殖分子基础复制许可的调节：染色质许可DNA复制因子Origin

ORCCDC6CDT1MCMsORCCDC6CDT1MCMsOrigin有丝分裂复制许可G1SG2/M11.细胞增殖分子基础p27和p53/p21抑制复制许可Origin

ORCCDC6CDT1MCMsORCCDC6CDT1MCMsOriginCyclinE(cyclinA&D)/CDKs有丝分裂复制许可p53p27p21G1SG2/M11.细胞增殖分子基础细胞周期中防止再复制CyclinE(cyclinD/CDKs)???p27,p21SKP211.细胞增殖分子基础三条途径防止单个周期内的

DNA复制后再复制CyclinAGemininCUL4泛素E3连接酶11.细胞增殖分子基础

ORCCDC6CDT1MCMsORCCDC6CDT1MCMsCyclinA有丝分裂CDKs+CyclinA抑制DNA再复制起点起点内复制G1SG2/M11.细胞增殖分子基础CyclinA缺失引起DNA多倍体对照CyclinAKOCyclinBKOABCD1dayEF2days11.细胞增殖分子基础八倍体细胞KOKOcontrolcycAKO11.细胞增殖分子基础Geminin

抑制复制许可，并且防止DNA再复制

起点

ORCCDC6CDT1MCMsORCCDC6CDT1MCMs起点Geminin复制再复制11.细胞增殖分子基础Geminin结合CDT1防止DNA复制许可

CDT1GemininCDT1复制许可不许可11.细胞增殖分子基础Geminin缺失引起多倍体，而

CDT1缺失时，细胞在G1期分裂CtrlGemininCDT1Geminin+CDT1KOKOKO11.细胞增殖分子基础GemininKOCDT1KOGem+CDT1KO1d2d3d部分多倍体G1期分裂的细胞（G1亚峰）controlGemcontrolCDT12N4N2N4N2N4N11.细胞增殖分子基础CDT1在S期被降解，防止DNA再复制

起点

ORCCDC6CDT1MCMsORCCDC6CDT1MCMs起点复制起始S期CDT1CDT1蛋白降解11.细胞增殖分子基础CUL4-ROC1-DDB1-L2DTL/CDT2-PCNA

泛素E3连接酶导致CDT1降解WD40repeatsPCNACDT1DDB1CUL4A/4BROC1L2DTL/CDT2CDT1降解DNA复制,紫外线,辐射等CDT1E2PIPPIP11.细胞增殖分子基础L2DTL缺失导致再复制和多倍体

ControlsiRNAL2DTLsiRNA肿瘤细胞90%具有60-90个染色体11.细胞增殖分子基础什么因素导致DNA复制而不分离？昆虫唾液腺细胞的多线染色体-十次复制与cyclin的关系？CurrBiol.2002May14;12(10):829-33.SisterchromatidsfailtoseparateduringaninducedendoreplicationcycleinDrosophilaembryos.11.细胞增殖分子基础问题2.

姐妹染色体如何分离？G1DNA复制有丝分裂问题系列二细胞如何准确地复制遗传物质及传给子细胞的？11.细胞增殖分子基础姐妹染色单体分离

不依赖于有丝分裂纺锤体蚱蜢细胞对照纺锤体形成抑制剂虽然细胞不能分裂，姐妹染色体还是能够分开11.细胞增殖分子基础Cohesin:SMC1SMC3SCC1SCC3Etc.姐妹染色体连结姐妹染色体分离中期后期11.细胞增殖分子基础DNA复制过程中

形成的姐妹染色体连结Esp1=separase11.细胞增殖分子基础分裂期Cohesin的分离分裂前期分裂后期分裂中期Polo=PLK前期：Polo将Cohesion磷酸化，姐妹部分分开中期后：Separase将Cohesion降解，姐妹完全分开11.细胞增殖分子基础Condesin凝聚蛋白:与Cohesin同一家族SMC2SMC4CAP-D2CAP-GCAP-H,etc.形成结构高度有序的染色体襻环11.细胞增殖分子基础有丝分裂中SCC1在着丝粒的酶解断裂使染色体分离-APC的作用

centromereSeparase=Separin=Esp111.细胞增殖分子基础Anaphase-PromotingComplex/CyclosomeubiquitinE3ligase(APC/C)complex:

有丝分裂主要的调节因子APC蛋白复合物包括：CDC27,APC11,APC4,APC13,CDC26,CDC20(orCDH1),AMA1,CDC23,MND2/APC15,CDC16,APC9,APC10,APC2,APC1,andAPC5.

APCCyclinB/CDC2PP失活的激活的APC11.细胞增殖分子基础APC/C：UbiquitinE3Ligase11.细胞增殖分子基础M-cyclins被APC/C降解

G2CycBCycB有丝分裂前期中期CycB后期CycBAPC/Cbinding11.细胞增殖分子基础有丝分裂蛋白被APC/C相继降解前中期中期后期末期11.细胞增殖分子基础问题3.

DNA复制过程中有丝分裂为何不发生？

Checkpointcontrol问题系列二细胞如何准确地复制遗传物质及传给子细胞的？11.细胞增殖分子基础ATR/CHK1细胞周期检验点激酶CDC25G2/M11.细胞增殖分子基础问题4.

DNA损伤或复制不完整，有丝分裂能否发生？

Checkpointcontrol问题系列二细胞如何准确地复制遗传物质及传给子细胞的？11.细胞增殖分子基础(IR,UV,replicationblock)ATM+ATRCHK2CHK1p53activationCDC25ACDK2/cyclinECDC2/cyclinBG1G2SM蛋白降解细胞质内滞留CDC25Cp21DNA损伤信号11.细胞增殖分子基础TheG1/G2checkpointsCDC25ACDK2SCFb-TRCPG1/S过渡G2/M过渡11.细胞增殖分子基础抑癌基因与细胞衰老-P21的被发现(十年工作