生物化学检验技术 课件 第五章酶学分析技术-陈武哲

职业教育医学检验技术专业教学资源库生物化学检验技术第五章酶学分析技术BASICCLINICALLABORATORYMEDICINE2目录酶学分析技术基本知识1酶活性测定方法2代谢物酶学分析技术酶活性测定的影响因素诊断酶学在临床的应用同工酶分析3333酶(enzyme)是由活细胞产生的对特异底物具有高效催化作用的蛋白质，属于生物催化剂，是临床酶学分析技术的主体。酶的概念第一节酶学分析技术基本知识酶学分析的重要内容之一是对酶进行测定，包括酶绝对质量测定和相对质量（酶活性）测定两种方式。酶绝对质量测定是将酶作为一种蛋白质，对其酶蛋白质量进行定量测定的方法酶活性测定（相对质量）是将酶作为一种催化剂，对其催化反应速率进行定量，以间接代表酶含量的测定方法。临床上广泛采用酶活性测定用于间接表示酶的含量一、酶测定的基础知识（一）酶活性的概念指在规定条件下，单位时间内底物的减少量或产物的生成量即酶促反应的速度。

V=Δ[P]/t或-Δ[S]/t第一节酶学分析技术基本知识底物浓度为〔S〕,产物浓度为〔P〕,时间为t，反应速度为v注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间内产物的生成量为好。

第一节酶学分析技术基本知识（二）酶活性单位定义：指在一定条件下使酶促反应达到某一速度时所需要的酶量。酶活性单位是一个人为规定的标准。惯用单位：酶活性测定方法的建立者所规定的单位。（极少用）国际单位：1IU指在规定条件（25℃，最适pH，最适底物浓度）下，每分钟转化1

mol底物的酶量。单位为IU/L。目前临床测定时为接近人体环境，反应温度常选择37℃，故将IU简写为U。催量（Katal单位）：1Katal指在规定条件下，每秒钟转化1mol底物的酶量，1U＝1μmol/min＝1×10-6/60s＝16.67nkatal第一节酶学分析技术基本知识(三)酶活性浓度及其计算

明确测定方法的酶单位定义，按照酶单位定义确定物质量、体积和时间的单位。步骤：运用公式进行计算。第一节酶学分析技术基本知识计算公式:产物的增加量每单位规定的保温时间1000（ml）酶单位/升=—————————×——————————×————————

每单位规定的产物增加量实际保温时间实际标本用量（ml）

分光光度法测定的计算公式

（A测定–A对照）·V总·106

每单位规定的保温时间酶单位/升=—————————×————————

·L·V标实际保温时间第一节酶学分析技术基本知识举例：血清淀粉酶测定（碘-淀粉比色法）中：若淀粉缓冲液（0.4g/L），用量1.0ml，血清0.02ml。（单位定义：100ml血清37℃，作用15mim每水解5mg淀粉为一个淀粉酶单位）。淀粉酶活性单位计算方法如下：第一节酶学分析技术基本知识(四)正常上限升高倍数概念：指用测得的酶活性结果除以参考范围上限。即ULN＝例：如某人血ALT测定结果为80u/L，该测定方法正常参考范围上限为40mmol/L，其ULN＝80/40＝2第一节酶学分析技术基本知识二、酶活性单位的校准酶活性测定的校准常用两种方式：一是用实际测定的摩尔吸光系数ε进行校准，二是用酶校准物进行校准。（一）用实测ε校准使用已知浓度的指示物标准品(如NADH、4-NP、4-NA等)或底物(如葡萄糖)等作为样本进行酶活性测定，根据测出的吸光度值计算出真实摩尔吸光系数ε，然后根据实测ε得出实测K值。第一节酶学分析技术基本知识（二）用酶校准物校准利用稳定的、定值准确的酶校准物或酶参考物进行校准后得到K值。第一节酶学分析技术基本知识三、酶促反应动力学

研究影响酶促反应的因素。影响反应速度的因素底物浓度酶浓度温度PH值激活剂抑制剂第一节酶学分析技术基本知识（一）

中间产物学说和米－曼氏方程E代表酶，S代表底物，ES代表中间产物，P代表产物1.中间产物学说：第一节酶学分析技术基本知识2.米-曼氏方程1913年Michaelis和Menten对中间产物学说进行数学推导，用简单的快速平衡或准平衡概念推导出了单底物的酶促反应方程式即著名的米－曼氏方程式中Vmax为最大反应速度，Km为米氏常数，[S]为底物浓度，V是底物S在不同浓度时的反应速度。Km是酶的特征性常数之一，只与酶的性质有关，而与酶浓度无关，具有重要的临床应用价值。第一节酶学分析技术基本知识（二）Km和Vmax的应用Km和Vmax的应用第一节酶学分析技术基本知识四、酶促反应进程(一)酶促反应进程曲线

t1t2时间t图5-1酶促反应进程曲线吸光度A延滞期线性期非线性期第一节酶学分析技术基本知识（二）酶促反应进程说明：1、延滞期：底物与酶结合启动反应阶段，持续时间1－3min2、线性期（零级反应期）：最大反应速度期，是测定酶活性最佳时期，持续时间1－5min。此期反应速度与底物浓度无关，而与酶活性成正比。3、非线性期（一级反应期）：底物消耗，反应速度不与酶活性成正比，而与底物浓度成正比。第二节酶活性测定方法按反应时间分类定时法连续监测法第二节酶活性测定方法一、定时法（终点法、两点法）

概念：

测定酶促反应开始后一段时间内底物的减少量或产物的增加量，计算酶促反应的平均速度。第二节酶活性测定方法

特点：优点：简单，不需要特种仪器。缺点：难以确定酶促反应是否处于线性期。

吸光度

图1定时法三种不同反应进程注意：固定时间法时间段的预定不宜太长，一般以30～60分钟为宜。第二节酶活性测定方法二、连续监测法概念：测定底物或产物随时间的变化量，又称为速率法

（连续监测法是临床实验室中测定酶活性浓度的最主要的方法。）第二节酶活性测定方法2．限定性底物法

以对－硝基苯麦芽庚糖苷（4NP-G7）为底物，经α-淀粉酶催化，水解为游离的寡糖(G5，G4，G3)及葡萄糖残基减少的对-硝基苯寡糖苷（4NP-G2，4NP-G3，4NP-G4）。4NP-G2、4NP-G3及部分4NP-G4，在α-葡萄糖苷酶催化下，进一步水解为葡萄糖和对-硝基酚（其摩尔数仅为酶解底物-4NP-G7的1/3，其余2/3还结合在4NP-G4中）。对-硝基酚的生成量在一定范围内与α-淀粉酶活性成正比实验原理第二节酶活性测定方法原理（continuouemonitosing）每隔一定时间（10～60s）连续测定酶反应中产物或底物的变化量称为连续监测法。又称动力法或速率法，终点法的测定两个时间点，该法进行多点连续测定。（连续监测法是临床实验室中测定酶活性浓度的最主要的方法。）第三节代谢物酶学分析技术分光光度法单酶反应技术酶偶联反应技术

在代谢物酶学分析技术中，分光光度法是最常用的测定手段。根据测定方法的原理不同，一般将其分为单酶反应和酶偶联反应两种技术。第三节代谢物酶学分析技术

单酶反应比较简单，一般将工具酶和待测物一起保温，可按照定时法或连续监测法对待测产物或底物进行测定，在相对应的氧化还原酶作用下产生可以直接检测的信号。一、单酶反应技术第三节代谢物酶学分析技术二、酶偶联反应技术

酶偶联反应是在反应体系中加入一个或几个工具酶，将待测酶生成的某一产物转化为可直接测定的产物，当加入酶的反应速度与待测酶反应速度达到平衡时，可以用工具酶的反应速度来代表待测酶的活性。第三节代谢物酶学分析技术（一）工具酶概念：

通常把酶学分析技术中作为试剂用于测定代谢物浓度或酶活性的酶称为工具酶（toolenzyme）。常用的工具酶多为氧化还原酶类，这是因为氧化还原酶的产物最容易被直接监测。第三节代谢物酶学分析技术常用工具酶的名称及其缩写符号名称缩写辅酶名称缩写符号乳酸脱氢酶LDHNAD＋己糖激酶HK苹果酸脱氢酶MDHNAD＋肌酸激酶CK6-磷酸葡萄糖脱氢酶G6PDNADP＋丙酮酸激酶PK谷氨酸脱氢酶GLDH

甘油激酶GK葡萄糖氧化酶GOD

脂蛋白脂肪酶LPL胆固醇氧化酶COD

胆固醇酯酶CE磷酸甘油氧化酶GPD

脲酶Ure过氧化物酶POD

肌酐酶Cr第三节代谢物酶学分析技术

例如葡萄糖的测定中，在己糖激酶（HK）催化下，葡萄糖和ATP发生磷酸化反应，生成葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)与ADP。前者在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)催化下脱氢，生成6-磷酸葡萄糖酸内酯，同时使NADP还原成NADPH，然后检测340nm吸光度的改变，间接测得葡萄糖浓度。在这里，血清葡萄糖为待测物，HK、G-6-PD为工具酶，其作用相当于试剂。第三节代谢物酶学分析技术（一）酶偶联反应酶偶联反应最简单的模式为：Ex为待测酶，A为底物，B为中间产物。A、B二物质的变化无法直接监测，此时可外加第二个酶Ei(为指示酶)，其底物为B，反应产物为P可直接测定。物为P可直接测定。第三节代谢物酶学分析技术1.酶偶联反应原理:

预孵育期先将Ei加入样本中保温，使内源性A和B消耗殆尽延滞期然后加入底物启动反应，开始反应速度较慢线性反应期随着反应的进行B的生成速度等于转化为P的速度，反应达到动态平衡非恒态期反应后期，底物已经大部分消耗，反应速度减慢第二节胰腺疾病的实验室检查酶偶联法测定ALT的吸光度变化图

在应用酶偶联法测定时，关键在于确定恒态期，因为只有恒态期才能代表酶活性。如酶促反应底物动力学所述，恒态期可以通过测定指示酶的Km和Vmax等动力学因数加以计算确定。第三节代谢物酶学分析技术2.常用指示酶及其指示反应（1）偶联NAD(P)+或NAD(P)H的脱氢酶指示系统（紫外吸收法）

用作工具酶的脱氢酶都是以NAD(P)H为辅酶的脱氢酶，例如LDH、MDH、G-6-PD、GLDH等，它们催化下列反应：

P+NAD(P)H+H+

PH2+NAD(P)+可对NAD(P)H在紫外吸收或紫外激发荧光进行测定

应用：ALT、AST、CK等酶活性测定。第三节代谢物酶学分析技术优点:应用广泛缺点：①要用紫外分光光度计，因为要监测340nm吸光度变化，这限制了它的应用；

②要求使用高纯度的酶和辅酶，增加费用；

③灵敏度低。这是因为NAD(P)H的摩尔消光系数只有6.22×103。第三节代谢物酶学分析技术（2）偶联H2O2的过氧化物酶指示系统（色原显色法）

POD可催化过氧化氢与某些色原反应，例如与4-氨基安替比林（4-AAP）和酚反应，将其氧化为有色物质，反应如下：Trinder反应：

POD2H2O2+4-AAP+酚醌亚胺（红色）+4H2O色原物质应用：GOD、COD、GPO、甘油氧化酶、尿酸酶（属于氧化酶类）等都可以将各自的底物氧化为过氧化氢，因此都可以与POD偶联，通过Trinder反应加以测定。第三节代谢物酶学分析技术优点：①在可见光范围测定，便于推广应用；②对酶的纯度要求不高，故生产方便，价格低廉；③灵敏度高于脱氢酶系统。缺点：容易受维生素C、尿酸、胆红素和谷胱甘肽等还原性物质的干扰，严重时测定结果会出现假性负值。目前一般采用双试剂剂型，在试剂1中加入抗坏血酸氧化酶、亚铁氰化钾等来消除维生素C、胆红素等的干扰。第四节同工酶分析概念：同工酶(isozyme)是指同一种属中由不同基因或等位基因所编码的多肽链单体、纯聚体或杂化体，具有相同的催化功能，但其分子组成、空间构象、理化性质、生物学性质以及器官分布和细胞定位不同的一类酶。由于同工酶在体内呈现组织器官或细胞内区域化分布，具有组织特异性，因而同工酶的测定具有很大的临床诊断价值。第四节同工酶分析一、同工酶产生的机制根据产生酶分子不同结构形式的原因，可将同工酶分为：(一)基因性同工酶基因性同工酶(geneticisozyme)或原级同工酶(primaryisozyme)是由不同基因所编码的多肽链所组成的酶蛋白。(二)次生同工酶次生同工酶或转译后同工酶是由同一基因、同一信使RNA转录生成原始的酶蛋白，再经过不同的化学修饰，如磷酸化、肽链断裂、糖链上的糖基增减等形成不同结构的酶蛋白，它们的免疫性往往相同。第四节同工酶分析二、同工酶的测定方法

同工酶氨基酸组成不同，等电点不同，电泳迁移率也就不同，据此可用电泳法分离鉴定。（常规实验室同工酶常用的测定方法。）

（一）电泳法

第四节同工酶分析（二）色谱法(层析法)根据同工酶分子荷电量不同，可用离子交换层析法加以分离。（用于同工酶的提纯和制备，方法费时繁琐不适用于临床同工酶的常规检测。）第四节同工酶分析

由于同工酶的一级结构不同，因而免疫学性质也不相同。可将同工酶分离纯化后制备抗血清，用于同工酶的分离鉴定。常用的方法有免疫抑制法、免疫沉淀法和免疫化学法。（三）

免疫法第四节同工酶分析（四）

光谱法

光谱法是控制酶促反应条件，用光谱光度分析进行酶活性测定的方法。光谱法选择性抑制法底物特异性分析法最适pH控制法热失活法利用一些化学抑制剂对同工酶的选择性抑制的特性，对同工酶进行测定的方法。利用同工酶对底物的Km及亲和力的差别，对同工酶进行鉴定的方法。利用各型同工酶对热的稳定性差异的分析方法。利用同工酶的最适pH的差异进行分析的方法。第五节酶活性测定的影响因素

满足酶促反应速率达到最大反应速率所需的条件。主要包括：①合适的底物及底物浓度；②理想的缓冲液及最适离子强度；③最适温度；④最适pH值；⑤合适的辅因子、激活剂浓度；⑥酶偶联反应中合适的指示酶和辅助酶的种类和浓度；⑦合理的测定时间；⑧合适的样本与反应试剂的比例；⑨足够的检测范围；⑩尽量除去各种抑制剂等。第五节酶活性测定的影响因素

某些情况下，为使最终测定系统达到最大的测定重复性，可考虑对最适条件进行适当修改一、样本采集和处理1．样本采集溶血标本不能用于血清酶的测定。2．处理静脉采血后的1h～2h内应及时离心分离出血清(浆)，并及时测定，避免血细胞因膜能量不足通透性增加导致血细胞内酶释放入血或因其他因素影响造成误差。

第五节酶活性测定的影响因素3．保存不同贮存温度时体液酶的稳定性(活性变化小于10%)酶室温(25°C)

冷藏(0～4°C)冰冻(-25°C)LD1周1d～3d§1d～3d§γ-GT2d1周1月ALD2d2d不稳定★ALT2d5d不稳定★AST3d1周1月CK1周1周1月ChE1周1周1周ALP2d～3d2d～3d1月ACP4h※3d＃3d＃5′-NT24h1周3月AMY1月7月2月LPS1周3周3周LAP1周1周1周注：★酶不耐融化；§与同工酶类型有关；※标本未酸化；＃标本加柠檬酸或醋酸至pH5.0第五节酶活性测定的影响因素第五节酶活性测定的影响因素4．样本与试剂的体积比应当严格控制样本与试剂的体积比，一旦确定，就不能随意改变。一般推荐样本与试剂的体积比为1∶10。第五节酶活性测定的影响因素二、试剂因素1．底物的种类对于专一性不强的酶，在选择选择底物时应注意以下几项原则：①一般选择Km最小的底物；②底物应有足够的溶解度；③酶对底物的特异性高；④底物的稳定性好。2．底物的浓度对于单一底物的酶促反应一般酶测定时底物浓度最好为Km值的10～20倍；而双底物反应的可能机制有乒乓机制(如ALT、AST)、有序反应(如LDH、GLDH)、随机反应(如CK)三种。第五节酶活性测定的影响因素3．缓冲液的种类、pH和离子强度理想的缓冲液应具备以下条件：①有足够的缓冲容量；②纯度高，不含有抑制酶活性的杂质；③受温度影响小，即pH不易受温度的变化而变化；④对酶活性表达有促进作用则更好；⑤对酶有稳定作用。常用缓冲液分为活性缓冲液、惰性缓冲液和抑制性缓冲液三大类。4．辅因子结合酶离开它们的辅基或辅酶就不能表现活性，因此在酶活性测定时，要保证辅基或辅酶的供给。第五节酶活性测定的影响因素5．激活剂能提高酶活性的物质都称为酶的激活剂，其中大部分是无机离子或简单的有机化合物。6．抑制剂凡是能降低酶的活性但又不引起酶分子变性失活的物质统称为酶的抑制剂。在设计和选择酶的测定方法时，应设法避免其对酶促作用的影响。第五节酶活性测定的影响因素三、方法学因素1．方法等级的选择在条件许可的情况下，测定酶活性时尽可能采用速率法，少用或不用定时法。2．检测底物或产物的选择产物是从无到有，反应显色明显，检测灵敏度和准确度较高。因此，原则上应选择测定产物的生成量而不是底物的消耗量。第五节酶活性测定的影响因素3．启动模式的选择底物启动模式(IFCC推荐采用)：指样本先与缺乏某种底物的试剂1预孵育一定时间后，再加入含这种底物的试剂2，开始启动样本中的待测酶的酶促反应。4．正向反应与逆向反应的选择正向反应是测定产物的生成量即测定吸光度的增加值，在生化分析仪上描述为正向/向上/(＋)；逆向反应是测定底物的消耗量，描述为负向/向下/(－)。四、仪器因素第五节酶活性测定的影响因素1．反应温度由于酶反应受温度影响很大，在测定时间内，反应体系的温度变化应控制在37C±0.1C内。2．反应时间

酶活性测定相关的时间是延滞时间和线性期监测时间。延滞期的确定可通过多观察浓度不等、病理情况不同的样本，选择延滞期最长者作为确定值，选择线性期最短的为监测时间的确定值。线性期时间的确定主要是通过读数次数和读数间隔来决定。第六节诊断酶学在临床的应用

小明最近厌油，食欲精神不振，去看医生，医生了解具体情况后给小明开了肝功能检查，发现ALT和AST都有升高，医生结合具体情况最后诊断为：急性甲型肝炎

接下来让我们一起去学习下看看医生为什么会下这个诊断吧第六节诊断酶学在临床的应用

酶是组织细胞合成的，通过细胞的分泌和胞吐作用进入血液、脑脊液、尿液及羊水等体液中。临床上可根据不同体液中酶浓度的变化来诊断各种疾病。第六节诊断酶学在临床的应用酶浓度的变化由细胞坏死或细胞膜通透性变化引起细胞内酶合成增加所致酶排泄障碍引起脏器或组织损伤提示组织再生、修复、异位分泌或提示恶性肿瘤的可能有梗阻存在通常开展测定的是血清酶或血浆酶。要全面了解影响各种血清(浆)酶变化的因素，首先要了解血清(浆)酶的分类及变化机制。第六节诊断酶学在临床的应用一、血液酶的来源血液中的酶根据来源及作用不同，可分为:血浆特异酶非血浆特异酶大多数在肝脏合成，当肝实质性病变时，该类酶在血中的浓度明显下降外分泌酶:源于消化腺或其他外分泌腺,其在血液中的含量与相应的外分泌腺的功能与疾病有关。细胞内酶：存在于组织细胞中，组织细胞病变、细胞膜通透性增加或细胞坏死等病理状态下，细胞内酶可大量进入血液，导致血浆酶活性显著增高。第六节诊断酶学在临床的应用二、血液中酶浓度的变化机制血液中酶浓度的变化原因由细胞坏死或细胞膜通透性变化引起细胞内酶合成增加所致酶排泄障碍引起由细胞坏死或细胞膜通透性变化引起酶合成障碍、中毒或遗传缺陷酶进入血液途径和清除方法的差异性第六节诊断酶学在临床的应用（一）酶合成异常

1．合成减少

原因：肝脏损害时由于酶的合成能力受损，血液中相应的酶减少，慢性肝病时更为明显。由于酶基因变异也可引起酶合成减少。

应用：肝豆状核变性(Wilson病)患者，血液中铜氧化酶可明显下降。第六节诊断酶学在临床的应用2．合成增多

原因：细胞对酶的合成增加或酶的诱导合成作用是血液中酶升高的重要原因。

应用：增生性疾病如骨骼疾病时，可因成骨细胞增生合成和分泌更多的ALP使血液中此酶增高。部分肿瘤患者血液中酶升高可能与肿瘤细胞中酶的合成增多有关。此外酶的诱导合成作用也可引起血液中一些酶的浓度增加。第六节诊断酶学在临床的应用（二）酶释放增加

1．细胞内外酶浓度的差异

由于非血浆特异酶在细胞内外的浓度差异大，从而对血清酶浓度增加速率影响大，只要有少量细胞受损，酶从细胞中释出，就可使血液中酶浓度明显升高。

当细胞损伤或病变时，大量细胞内酶释放入血是引起血清酶增高的主要机制。第六节诊断酶学在临床的应用

例如病毒性肝炎时ALT活性增高。（