生物化学检验技术 课件 第三章 生物化学检验常用分析技术与仪器自动化

职业教育医学检验技术专业教学资源库生物化学检验技术第三章生物化学检验常用分析技术与仪器自动化BASICCLINICALLABORATORYMEDICINE2目录12常用分析技术实验室信息管理系统与仪器自动化第一节常用分析技术光谱分析技术离心技术电化学分析技术电泳分析技术干化学分析技术自动生化分析技术一二三四五六一、光谱分析技术光谱分析技术利用物质具有吸收、发射或散射光谱谱系的特点，对物质进行定性或定量的分析技术。灵敏、准确快速、简便选择性强应用范围广生物化学检验中最基本和最常用的分析技术一、光谱分析技术

光谱分析技术吸收光谱分析可见光及紫外分光光度法原子吸收分光光度法红外分光光度法发射光谱分析火焰光度法原子发射分光光度法荧光光谱法散射光谱分析散射比浊法透射比浊法一、光谱分析技术（一）吸收光谱分析1.光的基本性质

光是一种电磁波，具有波动性和粒子性。波动性的特征是波长和频率。光的波长（λ）单位常用纳米（nm）表示。基于粒子概念的光量子能量与基于波动概念的频率或波长的关系可用以下公式表示，即E=hv=hC/λ式中：C为速度；v为频率；λ为波长；E为每个光子的能量；h为普兰克常数，其数值为6.626×10-34J·s。一、光谱分析技术2.紫外-可见分光光度法技术紫外-可见分光光度法（ultraviolet-visiblespectrophotometry）是根据物质对紫外光（200～400nm）及可见光（400～780nm）的特征吸收而建立起来的分析方法，其定量分析的依据是光的吸收定律，即郎伯-比尔定律。一、光谱分析技术郎伯比尔定律：

根据Lambert-Beer定律，当一束平行单色光通过均匀的非散射样品时，吸光度与溶液层厚度和溶液浓度成正比。入射光I0透射光I一、光谱分析技术

式中A为吸光度；K为比例常数，称为吸光系数；L为溶液层厚度，称为光径；C为溶液浓度根据Lambert－Beer定律，当溶液层厚度单位为1cm，浓度单位为1mol/L时，吸光系数K称为摩尔吸光系数（ε）ε是物质的特征性常数。在固定条件（入射光波长、温度等）下，特定物质的ε不变，这是分光光度法对物质进行定性的基础一、光谱分析技术3.分光光度法在生化检验中的应用

（1）对未知化合物进行定性分析（2）对待测物质进行定量测定1）标准曲线法2）比较法3）其它分析方法一、光谱分析技术1）标准曲线法根据Lambert-Beer定律，液体的浓度在一定范围内与吸光度成正比关系待测溶液测定吸光度后，从标准曲线上可查出其相应的浓度一、光谱分析技术制作和应用标准曲线时应注意下面几点：①当测定条件发生变化时（如更换标准品、更换光电池或光源以及试剂批号不同时），标准曲线应重新绘制②标准品应有高的纯度，标准液的配制必须准确③当待测液吸光度超过线性范围时，应将标本稀释后再测定④标本测定的条件应和标准曲线制作时的条件完全一致⑤标准溶液设置的浓度范围须足够大，应达到观察拐点

一、光谱分析技术2）比较法己知浓度的标准品和标本作同样处理，使用相同的空白，同时测定标准管和标本的吸光度，根据测定的吸光度及标准品浓度，可直接计算出标本的浓度，计算公式为：其中Cx和Ax为标本管浓度和吸光度，Cs和As分别为标准管浓度和吸光度。用标准品法定量时，标准品的浓度应尽量和标本管浓度相近。3）其他分析方法包括差示法、多组分混合物分析和利用摩尔吸光系数分析等方法。

Cx=(Ax×Cs)/As分子、原子或离子在辐射能的作用下，由基态或低能态跃迁到激发态，当它们返回基态或低能态时，以辐射的形式释放出能量，由此而产生的光谱一、光谱分析技术（二）发射光谱分析法

发射光谱火焰光度法荧光分光光度法一、光谱分析技术

火焰光度法基本原理：指在一定条件下，以火焰作为激发源提供热能，使样品中待测元素原子化，由于原子能级的变化，产生特征的发射谱线

火焰光度法临床应用：主要用于血清及尿液样品中钠、钾的测定基态元素M激发态M*

E热能（火焰）特征辐射固定荧光的发射波长而不断改变激发光（即入射光）的波长，并记录相应的荧光强度，所得到的荧光强度对激发波长的谱图称为荧光的激发光谱使激发光的波长和强度保持不变，不断改变荧光的发射波长并记录相应的荧光强度，所得到的荧光强度对发射波长的谱图称为荧光的发射光谱荧光的激发光谱荧光的发射光谱荧光光谱基本原理：荧光是分子吸收光能量被激发后，从激发态的最低振动能级跃迁返回基态时所发射出的光荧光光谱临床应用：大量具有生物意义的物质，都可采用荧光分光光度法进行分析测定，如氨基酸、蛋白质、核酸、酶和辅酶、嘌呤、嘧啶、卟啉、维生素等一、光谱分析技术18（三）散射光谱分析法利用悬浮颗粒混浊液的散射光强度或对入射光减弱的原理进行定量分析的方法散射光谱分析法

散射比浊法

透射比浊法

一、光谱分析技术一、光谱分析技术散射比浊法基本原理：一定波长的光沿水平轴照射，通过溶液时，遇到抗原抗体复合物粒子，光线被粒子颗粒折射，发生偏转，光线偏转的角度与发射光的波长和抗原抗体复合物颗粒大小和多少密切相关，光强度与复合物的含量成正比透射比浊法基本原理：当光线通过一定体积的溶液时，由于溶液中存在颗粒（抗原－抗体复合物）对光线的反射和吸收，引起透射光的减少，透射光的透光率和粒子的量成反比。通过测定透射光的透光率来反映粒子的量的方法即透射比浊法（一）离心技术的原理二、离心技术

离心现象是指物体在离心力场中表现的沉降运动现象。应用离心沉降进行物质的分析和分离的技术称为离心技术（centrifugaltechnique）。实现离心技术的仪器是离心机（centrifuge）。

离心是利用离心机产生的强大离心力来分离具有不同沉降系数的物质。微粒在重力场下移动的速度与微粒的大小、形态、密度、重力场的强度及液体的黏度有关。二、离心技术1.离心力当物体所受外力小于运动所需要的向心力时，物体将向远离圆心的方向运动。物体远离圆心运动的现象称为离心现象。也叫离心运动。离心运动是由于向心力消失或不足而造成的。二、离心技术2.相对离心力相对离心力是指在离心力场中，作用于颗粒的离心力相对于地球重力的倍数，单位是重力加速度“g”。RCF=1.118×10-5n2r

式中r为离心转子的半径距离，以cm为单位；n为转子每分钟的转数（rpm）。

二、离心技术3.沉降速度

指在强大离心力作用下，单位时间内物质运动的距离。4.沉降时间

在离心机的某一转速下把溶液中某一种溶质全部沉降分离出来所需的时间即沉降时间。

5.沉降系数颗粒在单位离心力场作用下的沉降速度，其单位为秒。沉降系数与样品颗粒的分子量、分子密度、组成、形状等有关，样品颗粒的质量或密度越大，它所表现出的沉降系数也越大。二、离心技术（二）离心技术的方法1.差速离心法

差速离心法是利用不同的粒子在离心力场中沉降系数的差别，在同一离心条件下，通过不断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分步沉淀的离心方法。主要用于一般及特殊样品的分离，例如分离细胞器和病毒。二、离心技术

操作过程一般是在离心后用倾倒的办法把上清液与沉淀分开，然后将上清液加高转速离心，分离出第二部分沉淀，如此反复加高转速，逐级分离出所需要的物质（如左图所示）。

返回目录26二、离心技术二、离心技术

优点1.操作简单，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开;2.可使用容量较大的角式转子；分离时间短、重复性高；3.样品处理量大。缺点1.分辨率有限、分离效果差，不能一次得到纯颗粒；2.壁效应严重，容易使颗粒变形、聚集而失活。差速离心法2.密度梯度离心法样品在一定惰性梯度介质中进行离心沉淀或沉降平衡，在一定离心力作用下把颗粒分配到梯度液中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。

二、离心技术（1）速率区带离心法速率区带离心法是根据被分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同，离心后分别处于不同的密度梯度层内形成几条分开的样品区带，达到彼此分离的方法。二、离心技术（2）等密度区带离心法

当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力场中，颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直沿梯度移动到它们密度恰好相等的位置上（即等密度点）形成区带，故称为等密度区带离心法。

二、离心技术

操作中，一般是将被分离样品均匀分布于梯度液中，离心后，粒子会移至与它本身密度相同的地方形成区带，收集好所需区带即为纯化的组份。主要用于科研及实验室特殊方面的样品组份的分离和纯化。返回目录

31二、离心技术二、离心技术优点缺点密度梯度离心法1.分辨率高，分离效果好，可一次获得较纯颗粒2.适用范围广3.颗粒不会积压变形1.离心时间较长；需要制备成梯度液2.操作严格，不宜掌握利用物质的电化学性质，测定化学电池的电流、电位、电导、电量等物理量的变化，从而测定物质组成及含量的分析方法电化学分析技术灵敏、准确仪器简单快速、简便价格低廉它是电化学和分析化学学科的重要组成部分三、电化学分析技术（一）离子选择电极分析法的基本原理离子选择电极是一类用特殊敏感膜制成，对溶液中某种特定离子具有选择性响应的电化学传感器。一般由敏感膜、内参比电极、内参比溶液和电极管组成，既可测定pH，也可测定Na+、K+、Cl-、Ca2+、Mg2+等离子活度或浓度。通常以离子选择性电极作为指示电极，饱和甘汞电极作为参比电极，插入被测溶液中构成原电池，通过测量原电池的电动势来求得被测离子活度或浓度。三、电化学分析技术ISE与参比电极共同浸入样品试液中构成一个原电池，通过测量原电池的电动势E，便可求得被测离子的活度或浓度。三、电化学分析技术K：常数（测量条件恒定时）+：阳离子选择电极；-：阴离子选择电极；R：气体常数；T：热力学温度；n：离子电荷数；F：法拉第常数；αx：离子活度。（二）常用的离子选择电极三、电化学分析技术常用的离子选择性电极（ISE）

玻璃膜电极敏感膜由玻璃材料制成，最常见为pH玻璃电极气敏电极气敏电极是基于界面化学反应对气体敏感而设计的一类敏化电极。如氨气敏电极酶电极酶电极是另一种敏化电极，其原理是将含酶的凝胶涂布于离子选择性电极的敏感膜上组成酶电极（三）离子选择性电极分析法测定的影响因素三、电化学分析技术离子选择性电极对任何标本的测量，都可能存在离子强度、络合剂及干扰物质的影响，不同的分析方法其影响的大小不同通常在标准溶液及标本溶液中加入与待测离子无干扰的浓度较大的电解质溶液，作为总离子强度调节缓冲液（totalionicstrengthadjustmentbuffer，TISAB）TISAB可保持较大且相对稳定的离子强度，使活度系数恒定；维持溶液在适宜的pH范围内，满足离子电极的要求；还能掩蔽干扰离子溶液中带电粒子在电场中定向移动的现象称为电泳电泳利用电泳现象对物质进行分离的技术叫电泳技术电泳技术四、电泳分析技术（一）电泳技术的基本原理

物质分子在正常情况下一般不带电，即所带正负电荷量相等，故不显示带电性。但是在一定的物理作用或化学反应条件下，某些物质分子会成为带电的离子（或粒子），不同的物质，由于其带电性质、颗粒形状和大小不同，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，因此可使它们分离。四、电泳分析技术电泳迁移率电泳迁移率是指在单位电场强度时带电粒子的迁移速度带电粒子由于各自的电荷和形状大小不同，因而在电泳过程中具有不同的迁移速度，形成了依次排列的不同区带而被分开。即使两个粒子具有相似的电荷，如果它们的分子大小不同，所受的阻力不同，因此迁移速度也不同，在电泳过程中就可以被分离迁移率与带电粒子所带净电荷成正比，与粒子的大小和缓冲液的黏度成反比四、电泳分析技术影响因素分子的形状与性质

球形移动速度快纤维状移动速度慢电场强度高电场强度,电泳速度加快，电流强度也增大，产热增多低电场强度,电泳速度减慢。电泳时间增长，增加了标本的扩散电泳缓冲液pH值:一般设在4.5～9.0为宜缓冲溶质:化学性质稳定、缓冲容量大、电导率低、离子移动性好离子强度:缓冲液的导电能力,以0.05～0.1mol/L为宜支持介质吸附作用：吸附作用可阻滞标本的移动，出现区带拖尾现象电渗作用：电场中液相对固相的相对移动称为电渗蒸发影响电泳的因素四、电泳分析技术（二）常用电泳技术的分类四、电泳分析技术按电泳方式分类移动界面电泳区带电泳稳态电泳四、电泳分析技术按有无固体载体介质分自由电泳支持介质电泳（三）电泳技术在临床检验中的应用四、电泳分析技术血清蛋白电泳1尿蛋白电泳2血红蛋白电泳3糖化血红蛋白电泳4免疫固定电泳5同工酶电泳6指将液态样品如血浆、血清、尿液等置于含有试剂的固相载体上发生反应，依照反应结果定量测定样品中特定成分的浓度或活度的一项技术干化学分析是一种专门使用固相载体试剂进行临床化学检验的分析仪，它通过反射光度法、差示电位法等方法定量测出样品中特定成分的浓度或活度干化学分析仪五、干化学分析技术（一）干化学分析技术的基本原理五、干化学分析技术干化学技术普遍采用多层膜固相试剂技术，即干式化学的多层膜试剂载体，它集中现代化学、光学、酶工程学、化学计量学和计算机技术于一体，已使其作为定量方法干式化学的多层膜试剂载体基于发射光度法的多层膜基于荧光技术和竞争免疫技术的荧光反射光度法多层膜基于差示电位法的离子选择电极的多层膜47理论基础：遵从Kubelka-Munk理论光反射率与固相层的厚度、单位厚度的光吸收系数以及固相反应层的散射系数有关系，当固相层厚度和固相反应层的散射系数固定时，光吸收系数同待测物的浓度成正比

1.反射光度法五、干化学分析技术48多层膜干片结构（1）样本扩散层（2）反射层（3）辅助试剂层（4）试剂层（5）透明支持层基于反射光度法的多层膜干片结构示意图五、干化学分析技术基于传统湿化学分析的离子选择电极原理，用于测定无机离子

2.差示电位法多层膜结构（1）离子选择性敏感膜（2）参比层（3）氯化银层（4）银层（5）支持层五、干化学分析技术五、干化学分析技术（二）干化学分析技术的影响因素1.仪器监测2.校准频度3.质控物4.干片试剂的储存与使用5.工作环境温度和湿度五、干化学分析技术（三）干化学分析技术在临床检验中的应用干化学自动分析仪已广泛应用于检验医学的各个方面，检测的项目已多达70余项，包括常规生化、内分泌激素、毒素、药物浓度分析以及特种蛋白等免疫学检验干化学分析仪的分类反射光度法系统胶片涂层技术分析系统袋式分析仪52干化学分析法的特点：速度快，灵敏度和准确度与典型的分离式仪器相近应用Lambert－Beer定律时必须符合3个条件：超微量，操作简单，占用空间小，使用过程中灵活机动性强脱离了传统的分析方法，所有的测定参数均存储于仪器的信息磁场块中五、干化学分析技术53区别点干化学湿化学试剂固相，大多无需定标，稳定周期长（数月），全血可直接上机检测液体，需要定标，稳定周期短，全血不可直接上机检测仪器磁卡校正，无需排水系统，分析前后无需清洗每次测试原则上需要校正，需要排水系统，测试前后需清洁反应载体固相介质反应杯检测方法反射光度法透射光度法电解质测定差示电位法离子选择性电极法理论基础Kubelka-Munk理论和Williams-Clapper公式Lambert-Beer定律干化学和湿化学生化检测的主要区别五、干化学分析技术六、自动生化分析技术自动生化分析技术的定义：

机械化的仪器设备模仿代替手工操作，即把生化分析中的加样、加试剂、混合、保温反应、检测、结果计算、显示、打印和清洗等步骤自动化的分析检测技术六、自动生化分析技术

自动生化分析仪器(automaticbiochemicalanalyzer)，是将生物化学分析过程中的取样、加试剂、去干扰、混合、保温反应、自动检测、结果计算、数据处理和打印报告，以及实验后的清洗等步骤自动化的仪器。

连续流动式离心式全自动半自动单通道多通道按反应装置的结构分按自动化程度分按同时可测定项目分分立式干片式六、自动生化分析技术（一）自动生化分析仪的类型1.分立式自动生化分析仪六、自动生化分析技术分立式生化分析仪工作流程示意图所谓分立式，是指按手工操作的方式编排程序，并以有节奏的机械操作代替手工，各环节用转送带连接起来，按顺序依次操作。即“顺序分析”样本针试剂针试剂盘反应杯冲洗站搅拌棒功能键反应盘基本结构包括样本处理系统、检测系统、清洗系统和计算机软件系统。六、自动生化分析技术（1）样本和试剂处理系统1）样本盘或样本架六、自动生化分析技术2）试剂盘和试剂瓶六、自动生化分析技术3）取液装置六、自动生化分析技术（2）反应系统1）反应盘和反应杯六、自动生化分析技术632）混匀装置压电型搅拌六、自动生化分析技术3）恒温装置六、自动生化分析技术恒温装置示意图（3）测定系统1）光路系统2）信号检测器六、自动生化分析技术（4）清洗系统六、自动生化分析技术

（5）计算机控制系统六、自动生化分析技术控制样品测定程序计算测定结果判断结果准确性显示和输出测定结果数据储存等

六、自动生化分析技术(二）干化学式生化分析仪

干片式分析仪是80年代问世的。分析仪是采用干化学(drychemistry)方法，将发生在液相反应物中的反应，转移到一个固相载体上，利用反射光度计检测即可进行定量检测的一类新型仪器。这类方法完全革除了液体试剂，故称干化学法。

其主要结构包括取样装置、干片试剂、恒温装置、检测系统、计算机控制系统。仪器的检测原理多为反射光度法、荧光反射光度法和差示电位法，灵敏度和准确度达到甚至优于分立式自动生化分析仪，在使用时不需配制试剂，而是使用厂家已经配备好的干片试剂，操作简便，速度快。六、自动生化分析技术（1）干化学生化分析仪的主要结构干片结构示意图散布层试剂层显色层支持层（2）干片试剂的基本结构六、自动生化分析技术

六、自动生化分析技术（3）干化学式生化分析仪的独特性能1.运行速度快，操作简单，检测范围广，主观误差和系统误差小2.检测程序可随机设置，既可单一项目成批分析，也可各种项目随机组合3.急诊优先功能4.仪器完全由微机控制，可对多种数据进行统计学处理5.有的分析仪采用了化学惰性“液囊式技术”，能将每个标本严格分开互不掺杂，降低了携带污染率，提高了检验结果的精密度分析方法

固定时间法终点法（一点终点法、两点终点法）

比浊法

两点速率法连续监测法（速率法、动力学法）（三）自动生化分析仪的分析方法六、自动生化分析技术

六、自动生化分析技术1.终点法A单试剂两点终点法B双试剂两点终点法

六、自动生化分析技术2.固定时间法A单试剂固定时间法B双试剂固定时间法

六、自动生化分析技术3.连续监测法A单试剂连续监测法B双试剂连续监测法

比浊法是一种通过检测物质对光的散射或透射强度来测定物质的方法。自动生化分析仪一般只做透射比浊分析。透射比浊法是在光源的光路方向测量透光强度，它常用于终点法测定。主要用于血清特种蛋白的测定，如载脂蛋白、微量蛋白、急性时相反应蛋白、免疫球蛋白以及某些药物监测等。

六、自动生化分析技术4.比浊法基本分析参数线性范围参考值范围分析时间波长分析方法标本量、试剂量、稀释量试验名称与编号试剂选择小数点位数反应温度反应类型校准参数（四）自动生化分析仪的参数设置六、自动生化分析技术

六、自动生化分析技术1.试验代码以数字、按顺序编号。2.试验名称试验名称也称通道名称，常以项目的英文缩写或数字来表示。3.分析方法有终点法、两点速率法、连续监测法等，根据试剂盒说明书选择其中一种。4.反应温度自动生化分析仪通常设有25℃、30℃、37℃三种温度，为了使酶反应的温度与体内温度一致，一般固定在37℃，此项一般在系统参数中设置。

5.波长单波长：适用于测定体系中只有一种组分或混合溶液中待测组分的吸收峰与其他共存物质的吸收峰无重叠时。双波长或多波长：可消除溶血、浊度等干扰物的影响，提高测定结果的准确性血红蛋白、胆红素、乳糜的光谱吸收曲线

六、自动生化分析技术6.反应类型有正向和负向两种，正向反应吸光度增加，负向反应吸光度下降。7.样品量与试剂量

一般按照试剂说明书上的比例，并结合仪器的特性，即样品和试剂最小加样量及加样范围、最小反应体积等，进行设置。

六、自动生化分析技术8.试剂选择

单试剂法：在反应过程中只加一次试剂的方法双试剂法：在反应过程中试剂分开配制和加入反应系统，可消除干扰和非特异性反应，稳定试剂，使检测结果更准确。双试剂

六、自动生化分析技术对于终点分析，测定时间的选择应充分考虑到干扰的问题。一点终点法的分析时间应设在待测物质反应将完成时，过早会由于反应未达到终点而影响结果的准确性，过迟则易受其他反应物质的干扰。两点终点法应选择合适的第一试剂和第二试剂加入时间，以消除样本空白和内源性物质的干扰。连续监测法应先仔细观察时间-反应进程曲线，从曲线上选择最佳的测定时间。9.分析时间六、自动生化分析技术

反应吸光度处于线性范围内时，检测结果与吸光度变化成正比，准确反映待测物浓度。六、自动生化分析技术10.线性范围1.仪器运行前操作程序（1）试验项目设置对试验组合(profile)、试验轮次(round)等的设置（2）试验参数设置除各测定项目外，还有试验项目间比值、结果核对等参数的设置（3）试剂设置根据有关试验参数，设置各试剂的试剂位、试剂瓶规格，必要时设定试剂批号、失效期等（4）校准品设置对校准品的浓度、数量和位置等进行设置（5）质控设置根据质控要求，设置质控物个数、质控规则、质控项目及相应质控参数等（6）样品管设置包括样品管类型、残留液高度（死体积）、识别方式等（7）其他设置如数据传输方式、结果报告格式、复查方式与复查标准等（五）自动生化分析仪的操作流程六、自动生化分析技术2.常规操作程序开机（自检、预热）设置开始条件（日期时间索引、轮次、样品起始号等）根据需要申请校准、质控和病人测定项目（包括架号、杯号或顺序号）装载校准品、质控物和病人标本核对仪器起始状态（未应用条码系统，采用顺序识别样品时，尤其要核对测定起始编号是否与样品架号和申请号相符）定标和质控测定检查定标和质控结果病人标本测定测定过程监控（试剂检查、结果观察分析）数据传递（打印报告，向检验管理系统传输，包括工作量统计、财务统计、病人情况追踪、质控分析等）测定后保养

六、自动生化分析技术

仪器操作者要非常熟悉仪器各种警示符号的含义与作用，根据警示符号来发现问题和解决问题；能熟练运用仪器的相关操作界面，并按报告单审核要求，对每一张检验报告单进行认真、仔细、严格的审查，确保结果准确无误后才能签发。六、自动生化分析技术3.测定结果检查分析和报告单审核第二节实验室信息管理系统与仪器自动化实验室信息管理系统和管理流程实验室自动化系统一二

实验室信息系统（LIS）是对实验室日常工作、科室管理、学科建设和实验室发展等方面所产生及所需求的信息，通过计算机收集、处理、存储