DB21T 3278-2020 饲用微生物制剂中凝结芽孢杆菌的检测　

备案号：73359-2020DB21MethodfordeterminationofBacilluscoagulansinfeeds辽宁省市场监督管理局发布 庆、刘恩、翟宏旭、曹艳子、顾艳丽、张英雪、杨乔乔、李晶晶、陆继爽、刘星、冷寒冰、曾楠。标准起草单位通讯地址：辽宁省大连市甘井子区营城子镇营旭路9号，联系电话：0411-66881饲用微生物制剂中凝结芽孢杆菌的检测本标准规定了饲用微生物制剂中凝结芽孢杆菌的检本标准适用于含有益微生物凝结芽孢杆菌的各种饲料添加剂中凝结芽孢杆菌的检凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008/ISO3696：1987，GB/T8170数值修约规则与极限数值的表GB/T14699.1饲料采样（GB/T14699.1-2005/ISO649GB/T20195动物饲料试样的制备（GB/T20195-2006/ISO6498：1998，实验用水参照标准：分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008/ISO36964主要仪器设备和玻璃器皿4.1恒温培养箱：50℃±1℃4.2恒温水浴锅：80℃±1℃4.3普通冰箱4.5振荡器或漩涡混合器4.6显微镜：1000倍24.8无菌玻璃或塑料培养皿Φ=90mm、无菌锥型瓶、无菌玻璃或塑料涂布棒4.9量筒：250mL4.10PCR仪4.12凝胶成像仪3器皿。样品采集后置于4℃~8℃环境内保存，并应及时送到微生物检验室进行检测。采样数量和方式按按照GB/T20195进行试样的制备，样品制备后应10的初始悬浮液1mL，加入9mL0.85%灭菌生理盐水，培养后，选取菌落数在30个～300个之间的平板计数。若平板中有较大片状菌落生长时，则不宜采用；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2以代表全皿菌落数。典型的凝结芽孢杆菌菌落形状不规则，无隆起，呈灰白色，不透明。然后从中选出5个特剂盒或常用方法以进行该项确证试验。养基(NA)（A.1）上，50℃±1℃培养24h±1h。从每一平板中选取至少1个良好分离的特征菌落，转接4将挑选纯化的菌落做革兰氏染色(A.2)镜检。凝结芽孢杆菌细胞应B.coagulansB.subtilisB.licheniformisB.laterosporusB.pumilus﹢ ﹢﹢ d﹢﹢+ ﹢﹢﹢ ﹢﹢+﹢ ﹢ d﹢﹢ ﹢d﹢﹢ ﹢d﹢﹢ ﹢d﹢﹢+﹢ ﹢﹢﹢5使用量(μL）513样。用DNA分子量标记物做参照。3V/被检样品出现555bp扩增带，凝结芽孢杆菌阳性9结果与报告9.1计算每块平板上凝结芽孢杆菌菌落数计数每块平板上的凝结芽孢杆菌菌落数a，6按照GB/T8170数值修约规则得a为62。9.2样品中凝结芽孢杆菌数的计算方法与报告d——第一个稀释度的稀释因子(未经稀释的液体样品的d值为1)。若第一个稀释度（10-4）经确证后的菌落数为170、166和238，第二个稀释度（10-5）经确证后的菌落数为50、75和按照GB/T8170数值修约规则得出每mL或每g样品中含凝结芽孢杆菌估计数为2按照GB/T8170数值修约规则得出每mL或每g样品中含凝结芽孢杆菌估计数为160000000CFU/g（mL）或1.6×108CFU/g7培养基和试剂A.1.1成分乙酸钠MgSO4MnSO4A.1.2制法溶解各成分于水中，必要时加热。调整pH值，使培养基pH值在室温时为5.5，121℃灭菌A.2革兰氏染色A.2.1结晶紫染色液A.2.1.1成分A.2.1.2制法A.2.2革兰氏碘液8A.2.2.1成分碘A.2.2.2制法将碘与碘化钾先进行混合，加人蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。A.2.3沙黄复染液A.2.3.1成分A.2.3.2制法A.2.4染色法滴加95%乙醇脱色，约30s，水洗；滴加沙黄复染液，复A.3细菌DNA提