《包装饮用水中铜绿假单胞菌的快速检测方法》

ICS67.160.20

CCSX51

团体标准

T/CBIA0XX—20XX

包装饮用水中铜绿假单胞菌的

快速检测方法

（征求意见稿）

202X-XX-XX发布202X-XX-XX实施

中国饮料工业协会发布实施

T/CBIA0XX—202X

包装饮用水中铜绿假单胞菌的快速检测方法

1范围

本标准规定了包装饮用水中铜绿假单胞菌的快速定性检测方法。

本标准适用于包装饮用水铜绿假单胞菌的检验。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引

用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修

改单）适用于本文件。

GB4789.1食品安全国家标准食品微生物学检验总则

GB8537-2018食品安全国家标准饮用天然矿泉水

GB8538食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法

GB19298-2014食品安全国家标准包装饮用水

3原理

铜绿假单胞菌是专性需氧微生物，液体培养基组合振荡培养的方式可以为铜绿假单胞菌提供

充分的营养条件和氧气环境，通过测量培养液浊度可以客观、便捷地识别微生物的生长状态。萘

啶酮酸等抗生素具有一定选择性，可抑制铜绿假单胞菌外的革兰氏阴性菌生长。对培养液划线分

离纯化菌落后，通过绿脓菌素试验、产氨试验等技术，可以对疑似菌进行鉴定。

GB19298-2014、GB8537-2018对铜绿假单胞菌的限量要求是0CFU/250mL，本方法采

用250mL等量定性检测，未检出/250mL的检测结果可等同于0CFU/250mL检测结果下作出

的风险评估结论。

4定义

CN本底浊度值CNbackgroundNTU

多次试验阴性对照样浊度的平均值。

因萘啶酮酸不易溶于水，故含有萘啶酮酸的CN液体培养基呈现微浑浊状态。在培养过程中，

具有孔状结构的滤膜会改变CN液体培养基的浊度，故将阴性对照的浊度定义为CN本底浊度。

5实验室要求

应符合GB4789.1中2实验室基本要求的规定。

6设备和材料

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除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其它设备和材料要求如下：

6.1膜过滤系统。

6.2无菌滤杯。

6.3无菌平头无齿镊子。

6.4无菌滤膜：微孔薄膜，直径47mm或50mm，孔径0.45μm。

6.5无菌锥形瓶及配套透气瓶塞：容积100mL。

6.6恒温振荡培养箱：温度36℃±1℃，转速150rpm。

6.7浊度计及配套比色管：测量范围宜0～200NTU。

6.8紫外灯检测器：波长360nm±20nm。

7培养基和试剂

7.1CN液体培养基：见A.1。

7.2无菌水：经121℃灭菌15min的纯水。

7.3CN琼脂：见A.2。

8检验程序

检验程序见图1。

水样过滤：将250mL水样过滤至滤膜

转膜：将滤膜转移至CN液体培养基中

培养：36℃±1℃，150rpm，24h

浊度辨别

肉眼观察肉眼观察

无明显微生物繁殖样品浊度有明显微生物繁殖

＞1.5倍阴性对照浊度

浊度测量划线分离可疑菌落

样品浊度

≤1.5倍阴性对照浊度

铜绿假单胞菌阴性按照GB8538或其它方法进行确证

结果报告

图1检验程序

9操作步骤及报告

9.1样品消毒处理

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用75%酒精等消毒剂对样品包装容器充分擦拭消毒后传入洁净室，去除大包装水样品的帽标

等塑料包装，再次用75%酒精等消毒剂对包装容器口盖处、外壁等充分擦拭消毒。

9.2初筛培养

9.2.1灭菌并组装过滤系统

在100级洁净工作台内进行无菌操作。将膜过滤系统过滤头灭菌并降温后，用无菌平头无齿

镊子夹取无菌滤膜的边缘部分，将滤膜网格面向上，贴放在已灭菌的过滤头滤床面上，将无菌滤

杯固定到已贴好滤膜的过滤头上。

9.2.2水样采集

对于小瓶包装水，直接在100级的洁净工作台内倒取250mL水样至无菌滤杯内。对于大瓶

包装水，在100级洁净环境中（或使用100级洁净保证的无菌采样器），抽取250mL水样并转

移到无菌滤杯内。

9.2.3水样过滤

在100级洁净工作台内进行无菌操作。打开滤泵过滤水样，待杯内水样过滤完毕后，小心卸

下过滤杯，用无菌平头无齿镊子夹取滤床上已过滤好的滤膜的边缘，转移滤膜至装有50mLCN

液体培养基的锥形瓶中，滤膜最终应完全与培养液接触，不应粘贴在瓶内壁上。

9.2.4阴性对照试验

每批次检测需做一个阴性对照，作为后续浊度判定的阴性参比样。按照9.2.3的方法，过滤

250mL无菌水并将该膜转移至另一瓶50mLCN液体培养基中，作为阴性对照。

9.2.5培养

将所有接种后的锥形瓶放置于36℃±1℃的恒温振荡培养箱内，150rpm转速，培养24h。

9.2.6初筛判定

9.2.6.1浊度观察方法

从培养箱中取出锥形瓶，将待观察样品的锥形瓶对向明亮光源处，轻缓摇晃锥形瓶使培养液

混匀，肉眼观察培养液体的浑浊度。

9.2.6.2阴性对照样浊度观察

按9.2.6.1观察阴性对照样，如阴性对照样明显表现为微生物繁殖的浊度，说明阴性对照样受

到污染，该次检测无效，需排查原因。如阴性对照样无微生物繁殖，仅呈现CN本底的浊度，则

按9.2.6.4测量其浊度。

9.2.6.3检测样品浊度观察

按9.2.6.1逐一将检测样品和阴性对照样对比，观察两者的浊度情况。如检测样品的浊度大于

阴性对照样，且明显表现为微生物繁殖的浊度，该样品可直接判定为铜绿假单胞菌初筛可疑样；

反之，如检测样品与阴性对照样的浊度无明显差别，则需按9.2.6.4测量样品浊度，以浊度值进行

判定。

9.2.6.4浊度测量方法

浊度测量的采样操作应在100级洁净工作台内进行。轻缓摇晃锥形瓶使培养液混匀，倒取或

吸取一定量的培养液至洁净干燥的比浊管中。

浊度测量操作可不在100级超净工作台内进行。宜选择测量范围约为0～200NTU的浊度计，

按浊度计说明书进行仪器维护及测量，每次浊度测量前都应用已知浊度的标液或零浊度水进行核

查。

9.2.6.5阴性对照样浊度测量及判定

按9.2.6.4测量阴性对照的浊度，如阴性对照样浊度≤2倍CN本底浊度，说明该批次检测

试验有效，该阴性对照样浊度值将作为本批次检测样品浊度判定的依据。

注：CN本底浊度值受多因素影响，与CN液体培养基的成分及含量、培养基配制及使用条

件、培养时间、滤膜材质有关，故试验中应固化这些变量因素。实验室应固化这些变量因素后，

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再积累一定数量的阴性对照浊度值，将阴性对照浊度值的平均值作为CN本底浊度值。实验室可

积累相关数据并验证后，适当调整判定依据的倍数（本方法建议为2倍）。

9.2.6.6检测样品浊度测量及判定

按9.2.6.4测量检测样品的浊度，并将测量值逐一与阴性对照样浊度值相比较，如检测样品的

浊度＞1.5倍阴性对照样浊度，则该检测样品判定为铜绿假单胞菌初筛可疑样；反之，如检测样

品的浊度≤1.5倍阴性对照样浊度，则该检测样品判定为铜绿假单胞菌初筛阴性样。

9.2.6.7初筛报告

对于铜绿假单胞菌初筛可疑样，需按9.3进行鉴定操作；对于铜绿假单胞菌初筛阴性样，以

铜绿假单胞菌未检出/250mL报告。

9.3铜绿假单胞菌鉴定

9.3.1平板划线及培养

在100级洁净工作台内进行无菌操作。轻缓摇晃铜绿假单胞菌初筛可疑样的锥形瓶使培养液

混匀，用无菌接种环沾取培养液，于CN琼脂平板上四区划线，以分离纯化单菌落。需划线3个平

板。平板倒置于36℃±1℃恒温培养箱，培养24h。

9.3.2GB8538法确证试验

分别在日光灯及360nm±20nm紫外灯下观察CN琼脂平板上生长的可疑菌落的颜色，参照

GB8538，按照菌落颜色选择做相应的确证试验，每种菌落表现类型选取不少于3个可疑菌落（当

不足3个时，则全部挑取）做确证试验。

9.3.3其它鉴定法确证试验

亦可通过其它鉴定技术对可疑菌落进行确证，如MALDI-TOFMS、16SrRNA测序等。

挑取不少于10个可疑菌落（当不足10个时，则全部挑取）做确证试验，按鉴定方法的具体要

求进行操作。

9.3.4确证报告

若按照9.3.2开展可疑菌落确证的，依据GB8538逐一判定可疑菌落是否为铜绿假单胞菌。

若按照9.3.3开展可疑菌落确证的，根据各方法的规则判定可疑菌落是否为铜绿假单胞菌。

如3个平板上有任一菌落确证后判定为铜绿假单胞菌，则该检测样品以铜绿假单胞菌检出

/250mL报告。否则，以铜绿假单胞菌未检出/250mL报告。

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附录A

（资料性附录）

培养基和试剂

A.1CN液体培养基

A.1.1成分

明胶蛋白胨17.6g

胰蛋白胨11.6g

硫酸钾（K2SO4）10.0g

氯化镁（MgCl2）1.4g

蒸馏水1000mL

CN补充成分

十六烷基三甲溴化铵0.2g

萘啶酮酸0.015g

A.1.2制法

将明胶蛋白胨、胰蛋白胨、硫酸钾、氯化镁溶解于1000mL蒸馏水中，加热溶解，121℃

高压灭菌15min。灭菌后，待培养基冷却至50℃以下时，加入溶于2mL灭菌蒸馏水的CN

补充成分，培养基25℃的pH为7.1±0.2。宜现配现用。

A.2CN琼脂

A.2.1成分

明胶蛋白胨16.0g

胰蛋白胨10.0g

硫酸钾（K2SO4）10.0g

氯化镁（MgCl2）1.4g

甘油