第八节 基因治疗与基因诊断课件

2.8基因治疗第八节基因治疗与基因诊断2.8基因治疗一、基因治疗的概念◆基因治疗（genetherapy）——就是向有功能缺陷的细胞补充相应功能基因，以纠正或补偿其基因缺陷，从而达到治疗的目的。2.8基因治疗NakedDNATargetCellTherapeuticProteinAAVRetrovirus/LentivirusAdenovirusNucleusGeneTherapyPrinciples2.8基因治疗原位修复(基因修复）：对有缺陷的基因在原来位置上进行修复，使该基因恢复正常基因替代疗法：治疗策略是切除发生缺陷的基因，再转入有功能的正常基因增强：将目的基因导入靶细胞，目的基因的表达产物可以补偿缺陷细胞的功能基因抑制：导入外源基因以抑制原有的基因，目的在于阻断有害基因的表达二、基因治疗的策略2.8基因治疗基因治疗的前景分析基因治疗：降低成本理论上所有治疗基因（包括非分泌蛋白）均可开展基因治疗基因治疗：技术上难度大，有效性和安全性要求高基因治疗：仅10余年历史，技术不够成熟，风险大2.8基因治疗三、基因治疗的两大途径2.8基因治疗1．体细胞基因治疗：把外源基因导入患者的体细胞，以治疗或预防基因接纳者个人的疾病，只有特定的个体受益，但不能遗传给后代。

2．种系细胞的基因治疗：在生殖细胞（精子、卵子或未分化的受精卵）中引入正常基因或修复缺陷基因以校正遗传缺陷。引入的外源基因（整合到基因组）能遗传给后代。优点：目的基因转移到机体的所有组织并遗传给后代。目前尚未开展，一是涉及伦理学问题；二是技术困难（诊断困难、引起新的插入突变的危险）

2.8基因治疗又称间接体内基因转移，基本途径是：个体供者

组织或细胞移植物

组织培养治疗基因或标记基因

培养细胞选择或富集转基因细胞转染细胞

实验动物或受试病人的靶器官

1.通过回体（exvivo）基因转移的治疗途径2.8基因治疗又称直接体内基因转移，将插入目的基因的表达载体直接导入体内的方法。基本途径是：含治疗基因表达载体直接注射/与介质结合后直接注射或用基因枪导入体内包装细胞系中包装好的复制缺陷型病毒颗粒优点：简便省时省力，能很快观察到外源基因的表达及作用缺点：DNA在体内不易进入细胞，易被降解，以病毒颗粒的形式导入人体则易引起免疫反应和被补体灭活。2.通过体内（invivo）基因转移的途径2.8基因治疗四、基因转移的方法病毒载体逆转录病毒载体腺病毒载体单纯疱疹病毒载体非生物学方法直接注射脂质体受体介导2.8基因治疗（一）基因治疗的病毒载体应该具有的基本条件：携带外源基因并能组装成病毒颗粒介导外源基因的转移和表达对机体没有致病能力2.8基因治疗充分了解载体病毒的基因组结构和功能（编码区/非编码区、结构蛋白/非结构蛋白、必须基因/非必须基因、包装容量等）外源基因插入病毒基因组的非必须区致病基因（裂解细胞、癌基因使细胞转化）删除插入外源基因长度受限删除非必须基因/必须基因（由辅助病毒或宿主细胞提供该基因的功能）病毒载体的产生2.8基因治疗◆反转录病毒(Retrovirus,RV)载体优点：基因转移的效率高，细胞宿主范围较广泛，DNA整合效率高于其它病毒载体等。缺点：只感染分裂状态的细胞，载体容量小（≤8kb），目的基因在未分化的细胞中常丢失，随机整合潜在致癌的危险。2.8基因治疗优点：安全，不整合到染色体上不需要宿主细胞的分裂增殖就能进入细胞缺点：免疫原性较强不能整合到宿主细胞基因组使得外源基因表达持续时间有限插入外源DNA的能力也有限（≤7kb）。

◆腺病毒(AV)载体2.8基因治疗优点：嗜神经组织能插入较长外源基因（20kb或略长些缺点：较大的基因组使得遗传操作较难进行不整合到宿主细胞基因组，表达持续的时间受限包含大量功能基因，安全水平尚待进一步观察◆疱疹病毒（HSV）载体2.8基因治疗

优点：安全，痘病毒在人类历史上已经广泛应用外源基因的容量可达30kb适用广泛的细胞型（可感染非分裂的细胞）缺点：不整合入细胞基因组，故外源基因表达的时间不能持久载体过大，受免疫系统的影响也较大。◆痘病毒（Poxvirus,PV）载体2.8基因治疗（二）非病毒载体1.裸DNA2.脂质体/DNA复合物3.多聚物/DNA复合物4.其它方法2.8基因治疗1.裸DNA方法：直接注射或基因枪轰击溶液类型对基因表达有影响：重组DNA可贮存于5%-30%的蔗糖溶液中也可用生理盐水或PBS2.8基因治疗2.脂质体/DNA复合物形成高效包装DNA的人造膜，与细胞膜极为相似。形成脂质双层包围水溶液的脂质微球，与细胞融合后被细胞内吞。2.8基因治疗无毒性和免疫原性可生物降解，不会在体内堆积可制成球状(0.03-50m)，包容大小不同的生物分子可带有不同的电荷具有不同的膜脂流动性、稳定性、及温度敏感性，能适应不同的生理要求人工脂质体膜具有如下特点2.8基因治疗阳离子多聚体DNA带负电细胞表面带负电3.多聚物/DNA复合物2.8基因治疗受体介导基因转移技术磷酸钙共沉淀法电穿孔法显微注射法4.其它方法2.8基因治疗

转入功能基因（单基因遗传病）血友病B薛京伦等用逆转录病毒载体将IX因子的cDNA至血友病B患者的皮肤成纤维细胞中，再回植患者皮下，患者凝血因子IX的表达明显增高，症状得到改善重症综合性免疫缺乏症（SCID）五、基因治疗的应用2.8基因治疗重症综合性免疫缺乏症（SCID）腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症是常染色体隐性遗传的致死性疾病，患者由于ADA缺乏导致脱苷腺氨酸增多，改变了甲基化能力，致使淋巴细胞受损，从而导致免疫缺陷1990年，首次将ADA转基因T淋巴细胞注射到人体骨髓组织（患有－－腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症的4岁儿童），治疗SCID2.8基因治疗基因治疗SCID的过程2.8基因治疗转基因治疗的问题与危险性有效的目的基因过少；安全性:导入的基因缺乏调控手段；有效性和稳定性：缺少高效和导向的载体系统；目前人们多重视分子水平的研究而忽略了整体研究，对整体宏观水平缺乏了解。1999年9月17日，美国Arizona州18岁的青年格尔辛格在宾夕法尼亚大学人类基因治疗研究所接受基因治疗4天后不幸死亡，成为基因治疗实施以来第1个直接死于这种试验的病人。

生物技术与医药卫生2.8基因治疗六、基因治疗关键问题1.靶向性基因导入系统基因治疗的关键问题是将治疗基因送入特定得靶细胞，并在该细胞中得到高效表达；2.外源基因表达的可控性导入基因后无调控表达将会产生严重后果。最理想的可控性是模拟人体内基因本身的调控形式；3.治疗基因过少

2.8基因治疗2.8基因治疗2.8基因治疗2.8基因治疗Fig.1.MapofrecombinantAd.RGD.mda-7andAd.RGD.pK7.mda-7adenovirusvectorsgenomesencodingmda-7.2.8基因治疗Fig.2.FigureshowingtheenhancedtumorkillingeffectofgeneticallymodifiedAd.RGD.pK7.mda-7andAd.RGD.mda-7virusescomparedtounmodifiedAd.mda-7.2.8基因治疗Fig.3.PBS(A)orcontrolvirusAd.GFPtreatedanimals(B),orAd.RGD.Pk7.GFPtreatedanimals2.8基因治疗Fig.4.SignificantinhibitionoftumorgrowthandbloodyasciteswasshowninAd.mda-7treatedanimals(C)andAd.RGD.pK7.mda-7treatedanimals(E).2.8基因治疗

基因治疗在未来人类重大疾病的预防和治疗上必将发挥越来越大的作用！2.8基因治疗七、基因诊断（GeneDiagnosis）G到T一个碱基的改变，决定了一个人的命运小皓珩出生23个月就出现皮疹、便血等病状，患上了罕见的原发性免疫缺陷病。DNA序列分析，证实了小皓珩WAS蛋白基因的1388位核苷酸由G突变为T，使编码谷氨酸的密码GAG突变为终止密码TAGWAS蛋白突变为无功能的WAS蛋白，导致患儿血小板减少，淋巴细胞形态和功能异常希望：WAS目前已经可以用骨髓移植或干细胞移植根治通过从患者体内提取样本(DNA)用基因检测方法来判断患者是否有基因异常或携带病原微生物的方法，就是基因诊断。生物技术与医药卫生2.8基因治疗传统与基因诊断的比较

传统的诊断望问

听

触——经验化验/检验——微生物、免疫学、生物化学、病理学等对细胞、组织、酶、代谢物等检测影像学—X线、B超、CT、核磁共振、内窥镜等特殊检查—肌电/脑电/心电、骨密度等基因诊断应用分子生物学方法：如PCR技术或PCR与分子杂交标记主要应用于先天遗传性疾患（苯丙酮尿症、血红蛋白病）后天基因突变引起的疾病（肿瘤、糖尿病）病原生物的侵入（流感、肝炎、艾滋病）个体识别、法医物证生物技术与医药卫生2.8基因治疗感染性疾病检测

利用PCR技术或PCR与分子杂交标记相结合，可以快速准确地检测出病原性物质乙型肝炎病毒丙型肝炎病毒结核杆菌和疟原虫的分型2.8基因治疗公安司法系统——罪犯及受害人的身份识别及亲子鉴定部队——伤亡士兵的身份识别；印尼海啸中死难人员身份识别保安——个人DNA身份证，用于人员识别个体识别14岁智障少女怀孕亲子鉴定牵出70岁嫌犯

2.8基因治疗作业：“英国研究人员2007年4月12日宣布，他们在世界上首次确认了一个与肥胖相关的等位基因，他们将之称为FTO。这一研究成果发表在《科学》杂志上