DB21T 3493-2021 牛体外受精胚胎生产 及非手术法移植技术操作规程

212021-08-30发布辽宁省市场监督管理局发布I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草单位：辽宁省农业发展服务中心、辽宁省牧经种牛繁育中心1牛体外受精胚胎生产及非手术法移植技术操作规程4.1.1二氧化碳培养箱4.1.2超净台使用前20min，打开风机和紫外线灯对操作台面和在超净台中使用的器材进行恒温加热板、水浴锅的使用温度为37℃,水浴锅中液体为蒸馏水。4.1.4液氮罐4.2溶液2抗菌生理盐水（含青霉素和链霉素各0.075g/L）、采卵液、成熟液（M199）、精液（BO液）、胚胎培养液（CR1aa）、胚胎冷冻液、4.2.2溶液配方4.2.3溶液的制备4.2.3.1基础溶液配制4.2.3.2成品溶液配制根据要求或试验设计，称量好所有药品后用基础溶液进行一次性溶解，然后用0两个月采卵一次。采卵前48h肌注FSH进行卵泡带有超声波探头和采卵针（18G或21G的一次性短针头）的采卵器插入到阴道穹隆处，通过直肠把握法将卵巢贴在探头上，在40mmHg（18G）或120mmHg（21G）负压下，根据B超屏幕上所显示的行穿刺。穿刺卵泡的表面直径为2mm～8mm。每头牛应单独采集，并标注好信息。采集3次，将收集的液体在37℃环境下，于4h内运回实验室。所用采卵液配方见附录A中A.牛屠宰后30min内摘取卵巢，置于盛37℃抗菌生理盐水的保3去除卵巢周围多余的组织，用37℃的抗菌生理盐水洗涤5次～6次。将洗涤好的卵巢与抗菌生理盐水一起置于37℃的恒温加热板上备用。采卵时，用消毒的纱布包裹住卵巢，用配有18号针头的10mL注射器从侧面穿刺，吸取表面直径2mm～8mm卵泡内的液体。可一次性将所有卵巢的），卵子洗涤盘（1mL～2mL受精液/次），于二氧化碳培养箱中液置于精子洗涤液中，以45°倾斜方式在二氧化碳培将体外培养20h～24h的卵母细胞在受精液中洗然后用受精液调试密度为1×106～6×106个/mL，置于二氧化碳培养），4氧化碳培养箱中预平衡。胚胎培养液配方见管吹打假设合子，去除周围残留的卵丘细胞和精子。将洗涤后的假设合子移入培养微滴中，10枚/滴，胚胎的等级评定应按照GB/T25881中的规定。胚胎质量分为A、B、C、D四个等级，其中Aa)保存液：含有0.4%牛血清白蛋b)1.5moL/L乙二醇冷冻液（含0.1moL）：将平衡后的胚胎装入0.25mL细管，装管顺序：冷冻液→气泡→冷冻液加胚胎→气泡→冷冻液。胚51——棉塞；2——冷冻液；3——气泡；4——冷冻液+胚胎；5——气泡；6——冷冻液；7——封口处；8——标签M左侧1表示数量，右下角数字1表示质量。标记后的冷冻胚胎放入液氮罐的液氮中，液氮罐应符合GB/T塞推出胚胎→解冻液平衡4min～5min→保6受体牛同期发情的处理方法应符合NY/T1572中的规定。以受体稳定站立接受其他牛爬跨为发情。），12.4.1.1对发情牛或发情处理的牛进行黄体直检，要求其直径在11mm～15mm以上，手感弹性好，质12.4.1.2对人工授精的牛进行授精记录核对，确保移植当天处于人胚胎发育周期与受体移植时间的对应关系见NY/T15受体牛胚胎移植的方法应按照DB21/T受体妊娠诊断的方法应符合DB21/T7溶液配方A.1采卵液配方M199NaHCO34.766LM199NaHCO38注：液体4℃保存；E2不需过滤；基础液保NaCl2ONaH2PO42OMgCl22ONaHCO3NaCl2O9NaH2PO