DB21T 3378-2021 辽宁省松材线虫病检验鉴定技术规程　

DB21TechnicalregulationonquarantineforthepinewiltdiseaseinL辽宁省市场监督管理局发布I 1 1 1 2 2 3 3 5 6 8 归口管理部门通讯地址：辽宁省林业和草原局（沈阳市和平区太原北街2号），联系电话：标准起草单位通讯地址：辽宁省林业发展服务中心（辽宁省林业和草原有（沈阳市和平区太原北街2号综合楼B-6），1辽宁省松材线虫病检验鉴定技术规程松材线虫Bursaphelenchusxylophilus（SteineretBuhrer）Nickle属于线虫门（Nematoda侧尾腺纲（Secernentea滑刃目（Aphelenchida滑刃总科（Aphelenchoidoidea滑刃科（Aphelenchoidoidae伞滑亚科（Bursaphelenchinae伞滑刃属2从表现出异常症状的松科植物或松木制品上4.1感病松树现地取样方法4.1.1感病松树典型症状4.1.2感病松树病症表现时间4.2松木及其制品取样方法采用贝尔曼漏斗法、浅盘法进行（参见附录C）。分离时间一般需要4h-12h。将分离液体收集管或者烧杯中，通过自然沉淀或使用离心机处理后得5.2镜检5.3培养5.4形态特征3根据松材线虫的形态特征、松材线虫和拟松材线虫形态5.5检验记录常用的分子生物学鉴定方法有松材线虫PCR检测、松材线虫自动化分子检测和实时荧光PCR检测。4℃恒温箱，一般在1个月内完成分离检验。），省级检验鉴定机构应当在收到送检样品10个工作日内出具检验鉴定报告报告样式参见附录I）检验鉴定结果可能为新增松材线虫病疫区和疫点时，省级检验鉴定机构应当在检验鉴定后3个工作省级检验鉴定机构每半年需将检验鉴定开展情况上报省林业和草原行政主管部门所属的防治检疫45雌虫：A.整体；F.体前部；G.阴门区；H-J6优先抽取尚未完全枯死或刚枯死的松树。可参照以下特征选择取样松如果检验有则不需要继续取样，如果没有要继续取样检验，直至全部取样部之间）、上部（主干与主侧枝交界处）3个部位取样。对于仅部分枝条表现症状的，在其表现症状的枝条上取样。对于树干内发现媒介昆虫蛹的，优先在蛹室在取样部位剥净树皮，用砍刀或斧头直接砍取100g-200g木片；或剥净树皮，用手摇钻从木质部表面至髓心钻取100g-200g木屑；或者将枯死松树伐倒，在取样部位分别截取2cm厚的圆7原木取样时在取样部位剥净树皮，直接砍取100g-200g木片；或用手摇钻从木质部至髓心钻取100g-200g木屑；或分别截取2cm厚的圆盘。松木制品进行取样时可直接砍取100g-200g木片；或直接带8将样品去皮后劈成长约1cm-4cm，直径1cm-3cm的细条或直接取木屑约10g置于漏斗中的面巾纸，之间，线虫游离出一定数量后可镜检，一般需要要轻轻打开止水夹，用培养皿或烧杯在橡皮管下接取分离液约10ml；或用离心沉淀管接取分离液9将线虫分离液取一滴放在载玻片上，将载玻片在酒精灯火焰上来回移动5s-6s，加热过度会破坏线虫体内器官或使其表皮熟化变白，影响观察。也可以将线虫分离液放在试管中，把试管放在60℃-65℃cinerea)或盘多毛孢（Pestalotiaspp.)，此外用镰刀孢（F下将盘多毛孢、镰刀孢或灰葡萄孢接种在PDA平板上，盘多毛孢或镰刀孢28℃恒温培养4d-5d，灰葡萄前体部特征雄虫尾部弓形雌虫尾部指形雌虫尾部短尾尖突拟松材线虫B.muctonatus（MamiyaetEnda）在形态学和生物学方面都松材线虫广泛，在松材线虫病的检验中常常可见，二者在形态上的主要区别在于：(表尖突，不超过2µm，一般为1µm圆锥形，末端有明显的尾尖突，长度在3.5µm-5µm线虫与裂解液置于离心管中。置于PCR仪，70℃条件下保温处理35min，在95℃条件下保温处理10min反应混合液在98℃预变性5s，进入循环98℃变性3s，52℃退火3s，72℃延伸40s，共30个循环，最PCR扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，电时间为30min。置凝胶于302nm透射紫外注：泳道M-标准DNA；47-49松材线虫；50-松材线虫自动化分子检测系统48，松材线虫自动化分子检测系统1121314151617181正向引物序列：5’-GAGCAGAAACG反向引物序列：5’-CGTAAAACAGATGGT循环阈值（Cyclethresholdvalue）Ct值：是在PCR扩增过程中，荧光信号开始由本阶段的拐点所对应的循环次数，是实时荧光定